Способ определения мутаций в культуре клеток е. coli wp2/тrр-/ и s.тuрнiмuriuм(нis-)

 

Изобретение относится к способу осуществления теста на мутагенность. Цель изобретения - упрощение способа . Исследование и рост клеток происходят в термостате. При этом используют субминимапьную жидкую среду. Рост и дифференциацию клеточных популяций регистрируют с помощью вертикального спектрофотометра. Тест на мутагенность используют как экспресстест веществ предполагаемых карциногенов. 3 ил. ствию мутагенного вещества, то. у неге также возможно развитие рака. В предложенном способе изменение мутности, вызванное изменением вязкости различных клеточных кланов, измеряют как изменение оптической плотности с помощью вертикального фотометра на определенной дпине волны и количество клеток в популяциях, на которые разделился клан, определяют как оптическую плотность. С помощью вертикального фотометра можно точно определить количество клеток в популяции бактерий как оптическую плотность, при том что результат измерений не зависит от осаждения клеток или изменения объема жидкости. Кроме того, измерение можно проводить с помощью вертикального флюрометра, нефелометра, люминометра ипи любого другого прибора, который может реI О) N( 4 tC О CD CM

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)4 G 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 3715344/28-14 (86) РСТ/FI 83/00053 (11. 07. 83) (22) 11. 03. 84 (31) 822473 (32) 12. 07. 82 (33) FI (46) 30. 11. 88. Бюп. Р 44 (71) Лабсистемз Ой (РТ) (72) Кай Фалк (ЕТ) (53) 612. 015 (088. 8) (56) Шлегель Я. Общая микробиология.

M.: Мир, 1972.

Изобретение относится к способам осуществления теста на мутагенность; который состоит в том, что на клеточную популяцию воздействуют мутагеном, в результате чего в части клеток происходят мутации, причем исходная клеточная популяция делится на подгруппы.

Цель изобретения — упрощение способа за счет уменьшения количества стадий.

Тест на мутагенность используется как экспресс-тест веществ предполагаемых канцерогенов, так как в тестах на мутагенность с бактериями было установлено, что, по меньшей мере, 90Х известных канцерогенов одновременно являются и мутагенами. На биологических образцах (к примеру, в случае мутагенного воздействия мочевины) можно установить, что если исследуемый объект подвергапся воздей„„SU „„1442090 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МУТАЦИИ В

КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК Е. COLI WP2(TRP ) И

S. ТУР1ПИПКЦЛЧ (HIS ) (57) Изобретение относится к способу осуществления теста на мутагенность.

Цель изобретения — упрощение способа. Исследование и рост клеток происходят в термостате. При этом используют субминимапьную жидкую среду.

Рост и дифференциацию клеточных популяций регистрируют с помощью вертикального спектрофотометра. Тест на мутагенносжь используют как экспресстест веществ предполагаемых карциногенов. 3 ил.

2 ствию мутагенного вещества, то у негс также возможно развитие рака.

В предложенном способе изменение мутности, вызванное изменением вязкости различных клеточных кланов, измеряют как изменение оптической плотности с помощью вертикального фотометра на определенной длине волны и количество клеток в популяциях, на которые разделился клан, определяют как оптическую плотность. С помощью вертикального фотометра можно точно определить количество клеток в популяции бактерий как оптическую плотность, при том что результат измерений не зависит от осаждения клеток или изменения объема жидкости.

Кроме того, измерение можно проводить с помощью вертикального флюрометра, нефелометра, люминометра или любого другого прибора, который может рез

144209 гистрировать количественное изменение роста клетонной популяции.

Первоначально однородную вкзотрофичеакую клеточную популяцию можно разделить на генетическом уровне с

5 помощью воздействия мутагена на экзотрофическую и прототрофическую подгруппы. С помощью фотометра, наблюдая рост указанны пвпуляцй которые 10 могут находиться в одной общей кювете, можно определить по кривой зависимости роста популяции от времени мутагенность образца, токсичность, природу токсичности (бактериостатическая, бактерицидная), распад токсического соединения в процессе исследования, а также факторы роста, если они присутствуют в образце. При этом необязательно работать с самим образцом или экспериментальными организмами;

Для установления частоты самопроизвольных мутаций (так называемая основа) необходимо сравнить образец с другими подобными, но не .содержащими мутагенов. Оперативность спосо- ба оценивают с помощью соответствующего образца,.содержащего известные мутагены. В зависимости от исследуемого образца проводят несколько параллельных. серий и/или его разведений.

В микробиологическом тесте на мутагенность можно использовать генетически точно определенные аминокислотные экзотрофические меченые бак35 териальные штаммы. Изменение в генотипе,. вызванное мутацией, обнаруживают как фенотипически измененные потребности. в факторе роста так, что клетки, на которые мутация воздействовала направленно, становятся независимыми от. влияния фактора роста аминокислот.

В предложенном способе первоначально генетически однородную популяцию бактерий подвергают воздействию мутагенов, в результате чего часть популяции мутирует из экзотрофов в прототрофы. Увеличение мутности в таким образОм п6лученной подгруппе можно обнаружить спектрометрически даже при субминимальном уров.,не с помощью вертикального фотометра

FP-901, поскольку изменения объема жидкости и осаждение бактериальных клеток не влияют на результат измерения поглощающей способности.

4

Когда все факторы роста аминокислоты были израсходованы, способность к росту сохраняли только клетки, содержащие мутацию. Чем больше введенная популяция клеток — мутантов в начале эксперимента, тем быстрее они достигают спектрометрически определяемой плотности. Время от начала эксперимента до момента измерения обратно пропорционально мутагенной активности данного образца. Кривая зависимости роста популяции от исходной поглощающей способности (так называемая кривая роста) дает, кроме информации о мутагенности образца, также сведения о факторах роста, содержащихся в нем, если они имеются.

На фиг. 1-3 показаны различные кривые роста (уровни поглощанзцей способности в функции от времени в логарифмнческом масштабе), Способ осуществляют следующим образом.

В тесте используют E.coli WP2 (trp ) и Salmonella typhimurium (his ) или любые другие удобные аминокислотные экзотрофические меченые штаммы. Рост и дифференциацию клеточных популяций регистрируют с помощью вертикального спектрофотометра

FP-901,причем изменение. уровня жидкости и осаждение клеток не влияют на. результат измерения поглощающей способности.

Исследование и рост клеток происходит при +37 C в термостате в наборе кювет по 1 кювете на образец, на среде Davis-Ningioli, Vogel-bonner или любой другой подходящей субминимальной жидкой среде. Исходный размер клеточной популяции 5 10, ее помещают в спектрофотометр FP-901 в собственном сосуде, в котором увеличение числа клеток вызывает изменение поглощающей способности ЙА 4„ /10 кле ток = 0,001. На стадии мутагениэации клетки делятся экзотрофически под действием фактора роста 5 раз. После того как фактор роста израсходован, рост экзотрофических клеток заканчивается, а клетки, мутировавшие в прототрофы, продолжают расти. Чем больше процентное содержание прототрофических клеток во всей популяции, тем быстрее они достигают плотности, которую можно измерить.

Время, прошедшее к моменту измерения, используют как количественную

:исходный уровень остатка =

О

1, = конечный уровень остатка

- D — В, 20

g — число генераций клеток—

О, — Dg/D = k,/t +-t -k /t

6) мутагенность препарата по длине кривой плато 1 (фиг.3);

7) число мутантов в момент време25 ни t о путем экстраполяции соотношения степеней роста по первой и второй логарифмических стадий;

D — обнаруженный размер конечной популяции;

= n — — — --, 2t/gt где и — процентное содержание в исходной.популяции (1.000); — время, прошедшее к моменту, когда превышен нулевой ypo(t0 1, 1 );

+ +

gt — время рбста {t„ — t ).

На фиг.2 кривая 5 показывает незамедленный рост, кривая 6 — бактерицидность (степень бактерицидности

50%), кривые 7 и 8 — неразрушающиеся бактеростатические вещества, кривая

9 — разрушающиеся бактериостатические вещества.

На фиг.3 1, — 1, (=а) показан расчет части ростового фактора.

По графику двухфазной кривой роста можно определить следующие факторы:

1) токсичность препарата;с начального момента первой логарифмической стадии (фиг. 1);

2) природу токсичности образца

45 (бактерицидно сть, бактериостатич-. ность, разрушающую бактериостатичность) по виду кривой роста первой логарифмической стадии;

3) скорость роста,немутировавших клеток по величине угла (К,), кото50 рый образует кривая роста первой логарифмической стадии (фиг.3);

4) скорость роста мутантов по величине угла (К ) второй логарифми1

55 ческой стадии (фиг.3);

5) факторы роста, при их наличии, присутствуницие в препарате, по величине поглощения на стадии плато

Зо

=1с /с -е — число делений на первой логарифмической стадии;

Ь

=1 /" „, -t -число делений на стадиях плато 1 и второй логарифмической стадии; — число мутантов в момент времени tz, D

2 + 2 6

Пример. Проведение теста.

Культивационная среда 965 мкл

Бактериальные клетки 5 мкл

Образец 10 мкл

Ферментативная активизирующая система S-9 20 мкл (если требуется).

Укаэанные компоненты Помещают в кювету объемом 1 мл, перемешивают с помощью вибратора 15 с, помещают в термостат при +37 С, выдерживают в спектрофотометре FP-901 при длине волны 405 нм, затем выдерживают

20-24 ч, в течение этого времени поглощакщая способность образца из5 1442090 6 оценку мутагенной активности в случае Число дополнительно. полученных с нетоксичными образцами. В зависи- мутантой, вызванных факторами роста, мости от скорости роста опытных ор- . определяют по формуле ганизмов, продолжительность исследоД 9- вания различна, в случае Е.со11 и Г„= 2 хяхг, S.typhimurium она не превышает 24 ч. где Гр — излишек мутантов после поКривая, полученная как функция . требления излишков факторов от величины поглощающей способности, раста; является иллюстрацией диакустическо- 10 g — число генераций клеток; го роста, r — количество мутантов в одной.

На фиг. 1 кривая 1 соответствует генерации, умноженное (х) незамедленному росту (нетоксичность, на размер популяции ($), степень выживаемости 100%), кривая

2 соответствует степени выживаемости 80Х кривая 3 — степени 50Х и кривая 4 — степени выживаемости 207.

Процентное содержание погибших клеток можно вычислить по формуле

7 1442090 8 меряется при длине волны 405 нм в ф о р м у л а и з î 6 р е т е н и я соответствии с запланированным режи- мом работы. Способ определения мутаций в кульИсходя из степени поглощения, туре клеток Е.coli MP2 (trp-) и строят кривую роста как функцию вре- $.typhimurium (his ) путем инкубации мены, по которой можно получить му- однородной культуры клеток с мутагетагенность препарата и некоторые ном с последующим определением налидругие параметры. чия мутирующих подпопуляций культуры клеток, отличающийся

"ефелометрическнй тест бактери- . тем, что, с целью упрощения способа ,алькой мутагенности удобен для всех за счет уменьшения количества ставидов исследований мутагенности, в днй, пробу исследуют в жидкой кУлькозорых необходимо установить, спо- туральной среде с помощью спектрофособен ли исследуемый образец взаимо- 15 тометра с вертикальным ходом лучей действовать с ДНК с образованием му« и по изменению оптической плотности таций. определяют мутацию клеток, 1442090

Ь dz б и 8s л (ИУ7. 7

НЮХ

d Р "" цжг

Составитель Е.Колмакова

Техред Л.Олийнык Корректор С.Черни

411 /и2 8+ig рфф

tg fg

Редактор М.Циткина

Заказ 450 Тирам 788 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета ао изобретениям и открытиям при ГЕНТ СССР

113035, Москва, 3-35, Рауиская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Укгород, ул. Гагарина,101