Способ получения липоксигеназы

 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения липоксигеназы, способной трансформировать жирные кислоты различной насыщенности. Перспективно применение продуктов реакции таких ферментов при предупреждении и лечении тромбоэмболических и геморрагических состояний человека, животных. Целью изобретения является повышение активности целевого продукта и ускорение процесса. Цель достигается направленным отбором штамма STR.SPHEROIDES ВКПМS-573 (М8-2) ПО ПРИЗНАКУ УВЕЛИЧЕННОГО СИНТЕЗА ЛИПОКСИГЕНАЗЫ. ШТАММ STR.SPHEROIDES М8-2 НА ИЗВЕСТНОЙ СИНТЕТИЧЕСКОЙ СРЕДЕ ПРОСТОГО СОСТАВА К 48 Ч КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА СРЕДЕ С РН 8,0 СТАБИЛЬНО ОБРАЗУЕТ ВЫСОКОАКТИВНУЮ ЛИПОКСИГЕНАЗУ В КОЛИЧЕСТВЕ 3,0 ЕД/Г БИОМАССЫ. 1 ТАБЛ.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHGMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4190486/31-13 (.22) 05,12.86 (46) 15.04.89. Бюл ° N - 14 (71) МГУ им. М.В.Ломоносова (72) Н.С.Егоров, M.À.Àëü — Нури, А.IO.Кривова, Н.И,Прянишникова и Е.А.Васильева (53) 663.18(088.8)

I (56) Авторское свидетельство СССР

Р 888542, кл. С 12 N 9/02, 1980.

Авторское свидетельство СССР

Ф 1010127, кл, С 12 N 15/00, 1982.

S.Satonetal, Isolation of Lipoxygenase-like. Agr. Biol Chem. 1976, 40, (5), р.953-961. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПОКСИГЕНАЗЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения липоксигенозы, способной трансформировать жирные кислоты различной насьпценности.

Изобретение может быть применено в микробиологии, фармакологии, медицине и медицинской промьппленности.

Цель изобретения — повышение активности целевого продукта и ускорение процесса.

Изобретение заключается в использовании в качестве продуцента липоксигеназы штамма Streptomyces sphегоides BKIIMS-573, известного ранее как продуцента протеолитических ферментов, рН среды в процессе культиви„,SU» 14725 1 А1

<5D 4 С 12 N 9/02//(С 12 N 9/02, С 12 R 11465) получения липоксигенаэы, способной трансформировать жирные кислоты различной насьпценности, Перспективно применение продуктов реакции таких ферментов при предупреждении и лече-. нии тромбоэмболических и геморрагических состояний человека, животных.

Целью изобретения является повышение активности целевого продукта и ускорение процесса, Цель достигается направленным отбором штамма Str.

sphегоides ВКПИ S=573 (M8-2) по признаку увеличенного синтеза липоксигеназы. Штамм Str.sphегоides M8-2 на известной синтетической среде простого состава к 48 ч культивирования на среде с рН 8,0 стабильно образует высокоактивную липоксигеназу в количестве 3,0 ед/г биомассы. 1 табл, 2 рования поддерживают равным 8,0, оптимальным для биосинтеза фермента.

Пример 1. Штамм S ° sphегоides BKIINS-573 (а.с. 11 1010)27) культивируют на среде следующего состава, мас. /: NaNO О, ); MgSO< 7Н О О, 01; КН РО

0,1; соевое масло 55 при рН-8,0 (доведение рН осуществляют 10 Н NaOH, чтобы не вводить новых ионов). Длительность культивирования составляет

3 сут. (72 ч). Полученные данные сведены в таблицу.

Активность липоксигеназы определяют при помощи электрода Кларка .ло поглощению кислорода, а в качестве субстрата используют линолевую и арахидоновую кислоты.

1472501 таит обладает активностью 3,0 ед/г . биомассы.

3а единицу активности принято количество фермента, необходимого для поглощения 1 ммоль кислорода при трансформации субстрата в течение минуты при 30 С.

Пример 2. Актиномицет S.sphегоides S-573 выращивают на скошенной агаризованной среде, содержащей, r/x: кукурузный зкстракт 10; крах— мал растворимый 10; аммоний сернокислый 3; натрий хлористый 3; кальций углекислый 2; агар 20; рН 8 при 28 С в течение 7 дней.

Посевным материалом служит суспензия спор культуры S.sphегоides

BKMIIS-573. В 1 мл суспензии должно содержаться около 2 млрд. спор (определяется IIQ стандарту мутности). Посевной материал вносят в количестве

1Х синтетической среды известного состава, содержащий, г/л: глюкоза

40; калий фосфорнокислый (однозамещенный) 2; магний сернокислый 5,7; аммоний сернокислый 1,25, рН 8, ос-. тальное вода.

Выращивают на качалках 180200 об/мин в колбах емкостью 750 мл со 100 мл среды в каждой в течение

48 ч при 28 С. 25

Мицелий отделяют от культуральной жидкости при помощи центрифугирования в течение 10 мин. При 4000 оборотов в минуту. Отделенный мицелий промывают трижды физиологическим 30 раствором; Далее мицелий разрушают ультразвуком в течение 5 мин при интенсивном охлаждении и центрифугируют в течение 20 мин, при 18 тыс. оборотов в минуту. Полученный суперна!

Таким образом, способность к синтезу липоксигеназы у предлагаемого штамма выше, чем у известного, что делает штамм Str.sphегоides перспективным для применения в микробиологической и медицинской промышленности для получения активной дипоксиге-, назы.

Предлагаемое изобретение также может быть использовано в биохимии, физиологии животных и фармакологии.

Формула изобретения

Способ получения липоксигеназы, предусматривающий культивирование продуцента на питательной среде,до доСтижения максимального уровня активности, отделение мицелия и разрушение его, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта и ускорения процесса, в качестве продуцента используют штамм Streptomyces sphегоides BKIIMS-573, а культивирование ведут на питательной среде с рН 8,0, Активность липоксигена35I HN G

Длительность рН

Штаммы культиви рования,ч г биомассы.мин субстраты

Линолевая Арахидоновая кислота кислота

Fusarium

ozysporum

Streptomyces sphегоides S-573

0,6

2,4

168

6,0

3,0

72 11,2

8 0

Сост а вит ель И. Привалова

ТехРед Л. Сердюкова КоРРектоР В.Романенко

Редактор И,Сегляник

Заказ 1674/28 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская иаб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101