Способ получения бактериальной холинэстеразы

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а точнее к технологии получения внеклеточной бактериальной холинэстеразы. С целью упрощения способа и повышения чувствительности к ингибитору-эфиру карбаминовой кислоты - прозерину в качестве продуцента холинэстеразы используют культуру PSEUDOMONAS AURANTIACA КМ-875, которую выращивают на жидкой аэрируемой среде, содержащей ацетилохолин в качестве индуктора, с последующим выделением конечного продукта и оценкой чувствительности фермента к ингибитору-прозерину в концентрации 10<SP POS="POST">-6</SP> М. Преимущество предложенного способа заключается в том, что полученная бактериальная внеклеточная холинэстераза гидролизует ацетилтиохолин и ингибируется прозерином (в концентрации 10<SP POS="POST">-6</SP>М) за 30 мин, т.е. полученный целевой продукт имеет чувствительность к прозерину на 3-4 порядка выше, чем у фермента, получаемого известным способом. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

4ь

Ю

СЛ

СР

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР (21) 4!53746/31-13 (22) 01.12.86 (46) 15.04.89. Бюл. ¹ 14 (71) Ленинградский технологический институт им. Ленсовета (72) В.Г.Шмелева, Н.П.Цветкова, В.А.Апухтин и M.È.Ãoí÷àðoâa (53) 537.15(088.8)

I (56) Великанов H.Ë., Колесникова H.Ã, и С.П,Лях. Ацетилхолинэстеразная активно Th бактерий из рода Рзеийошоnas — Микробиология, 1975, 44, ¹ 4, стр. 761-760..

:Goldstein D.Â., Goldstein А. "An

adaptive bacterial cholinesterase

from à pseudomonas species . J. gen.

Hicrobiol., 1953, 8, р.8-17, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ

ХОЛИНЗСТЕРАЗЫ (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, а точнее к технологии получения внеклеточ1

Изобретение относится к микробиологической промьппленности, а точнее к технологии получения внеклеточной бактериальной холинэстеразы.

Цель изобретения — упрощение способа и повышение чувствительности к ингибитору — эфиру карбаминовой кислоты — прозерину.

Сущность изобретения заключается в том, что в качестве продуцента хо.линэстеразы используют культуру Pseudomonas aurantiaca-875 из Всесоюзной коллекции микроорганизмов (ВКМ},.

„„SU„„1472502 А1 (50 4 С 12 N 9/16 // (С 12 N 9/16, С 12 R 1:38) ной бактериальной холинэстеразы. С целью упрощения способа и повышения чувствительности к ингибитору-эфиру карбаминовой кислоты — прозерину в качестве продуцента холинэстеразы используют культуру Pseudomonas aurantiaca КИ-875, которую выращивают на жидкой аэрируемой среде, содержащей ацетилохолин в качестве индуктора, с последующим выделением конечного продукта и оценкой чувствительности фермента к ингибитору-прозерину в концентрации 10 М. Преимущество предложенного способа заключается в том, что полученная бактериальная . внеклеточная холинэстераза гидролизует ацетилтиохолин и ингибируется прозерином (в концентрации 10 М) за

30 мин, т. е. полученный целевой продукт имеет чувствительность к прозерину на 3-4 порядка выше, чем у фермента, получаемого известным способом. 3 табл.

В качестве антихолинэстеразного вещества используют прозерин (эфир карбаминовой кислоты) в концентрации

10 И. Антихолинэстеразную актив ность соединений выражают величиной

pI 50, которая соответствует отрицательному логарифму молярной концентрации вещества, вызывающей угнетение холинэстеразы íà 50Х.

Пример 1. Процесс получения внеклеточной бактериальной холинэсте разы, чувствительной к прозерину 1472502 активность холинэстеразы по ацетилтиохолину в качестве субстрата и чувствительность к прозерину. Выбор продуцента внеклеточной холинэстеразы проводят в три этапа. На первом этапе культуру бактерий выращивают на мясопептонном агаре (MIIA) с добавлением 0,2% ацетилхолина в течение

24 ч. Выросшие клетки суспендируют в буфере и определяют эстеразную активность по скорости гидролиза индофенил ацетата (ИФА) . Активность фермента клеток выражают в условных единицах-минутах, необходимых для перехода неокрашенного субстрата ИФА в окрашенный продукт индефенол.

Эстеразная активность клеток исследованных продуцентов приведена в табл.l.

Таблица 1

Гидролиз

ИФА, мин

Продуцент

Pseudomonas putida

-"- aureofaciens

-"- aurantiace

†",- fluorescens — — МГУ.

fluorescens

Pseudomonas fluo4133

970

894

rescens е

1 этапе продуцентов проводят на мясопептонном бульоне (МПБ) с добавлением 0,2% ацетилхолина в колбах, на о качалке при t=28 С в течение 72 ч.

Клетки отделяют центрифугированием, активность фермента измеряют по скорости гидролиза ИФА и ацетилтиохолина. (простигмину) проводят следующим образом.

Культивирование продуцента Pseudoтопая aurantiaca BKM-875 осуществля5 ют в условиях аэрации на питательной среде следующего состава, (%): фруктоза 0,8; калий фосфорнокислый двух" замещенный О,1; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,1; магний сернокислый 0,03; кальций хлористый 0,01; ,натрий хлористый 0,01 дрожжевой экстракт 0,05; аммоний фосфорнокислый двухзамещенный 0,2 (по азоту);.ацетилхолин 0,2 при значении рН среды равном 7 — 7,2. Инокулят вносят в расчете 10% по объему. Выращивание проводят в 700 мл колбах с 50 мл среды на качалке при t=28 С в течение 72-86 ч.

Выросшую биомассу отделяют центрифу"

1 гированием. В супернатанте определяют

То же

t1»

»11

»11»

)!

11

1I

11

Il

11

11

11

-"- aurantiaca

В качестве возможных продуцентов холинэстеразы отбирают культуру, клетки которых гидролизуют ИФА не более, чем за 2-3 мин. На 2-м этапе выбор продуцента проводят по эстеразной активности фермента нативного раствора после отделения клеток центрифугированием. Выращивание отобранных на

895 896

541

542

553

561

2404

2813

2018

875

3 5-4

1,5-2

5

2,5

5

5

5

5 г

5

4-5

2,5

2-3

2,5 — 3

1472502

Из данных табл.2 следует, что среди культур, обладающих эстеразной активностью и отобранных на

5 этапе, только культура Pseudomonas

aurantiaca-875 синтезирует внеклеточную холинэстеразу, гидролизующую ацетилтиохолин. На третьем этапе выбор продуцента внеклеточной холин10 эстеразы проводят по способности ингибироваться прозерином. Способ получения внеклеточной холинэстеразы, чувствительной к прозерину, иллюстрируется следующим примером.

15 Пример 2. Односуточную культуру Рзеийошопаз аигапс аса 875 выращенную на косяках с МПА с 0,27.— ным ацетилхолином, переносят в жидкую питательную среду указанного в при20 мере 1 состава. Выращивание продуцента проводят в колбах с 50 мл срео ды на качалке при 28 С в течение

168 ч, Через каждые сутки определяют активность фермента в нативном растворе после отделения клеток центрифугированием, По скорости гидролиза

ИФА, скорости гидролиза ацетилтиохолина определяют содержание биомассы и и белка в нативном растворе, рассчи30 тывают удельную активность. Результаты эксперимента приведены в табл.3.

Таблица 3

Таблица 2

Продуцент

Гидролиз

Эстеранзая активность по ИФА ацетилтио холина клетки супернатант.

Pseudomonas

aureofaci—

ens 4133

-"- auranС аса

fluorescens 2404

- - fluorescens 2018

fluorescens 4125

-"- aurantiaca 875

ArthrоЬасter globiforme н.о. н.о. н.о. н.о. н,о, О, 105

0,138

0,296

0,440

0,648

0,778

0,820

0,990

О

9,0

13,9

17,8

18,5

14,9

13,1

6,9

0,98 1,2

2,38 1,5

5,54 3,0

7,37 6,8

8,00 8,3

7,72 7,8

7,25 6,7

6,79 . 3,0

0 . 1,24

4,12

7,84

12,00

11,60

10,80

6,80

24

48

72

96

144

168

5S

Определяют чувствительность синтезированной холинэстеразы к эфиру карбаминовой кислоты (йрозерину). Ве личина р I равна 6,0.

Зстеразная активность продуцентов, выращенных на М!Б с 0,27 ацетилхолином — 72 ч приведена в табл.2.

Как следует из приведенного примера., синтез внеклеточной холинэстеразы начинается в конце первых суток и продолжается в течение четырех последующих, Максимальную активность наблюдают к 96 ч роста культуры.

Преимущество предлагаемого способа заключается в том, что полученная бактериальная внеклеточная холинэстераза гидролизует ацетилтиохолин и ингибируется прозерином в концентрации

10 M за 30 мин, т.е. полученный целевой продукт имеет чувствительность к эфиру карбаминовой кислоты (прозерину) на 3-4 порядка выше, чем у фермента, получаемого известным способом.

1472502

Составитель В. Соина

Редактор И.Сегляник Техред Л.Сердюкова Корректор В.Романенко

Заказ 1674/28 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 с

Производственно-издательский комбинат "Патент" ° r.Óæãîðîä, ул. Гагарина,101

Формула изобретения

Способ получения бактериальной холинэстеразы, предусматривающий культивирование продуцента на жидкой аэрируемой питательной среде, содержащей ацетилохолин в качестве индуктора, выделение конечного продукта с последующей оценкой чувствительности фермента к ингибитору прозерину, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения чувствительности к прозерину, в качестве продуцента исполЬзуют

Pseudomonas aurantiaca ВКИ-875.