Способ получения иммобилизованной холинэстеразы

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в сигнализаторах токсичности и анализаторах метаболитов, а также в ферментативных реакторах для синтеза ценных биоорганических препаратов. Целью изобретения является увеличение стабильности иммобилизованных холинэстераз. Способ заключается в проведении ковалентного или адсорбционного связывания холинэстераз на силохроме с последующим введением силохрома со связанными ферментами в смесь воды и макродиизоцианата и перемешиванием гетерогенной системы до вспенивания и отверждения. Соотношение микродиизоцианата, воды и силохрома устанавливают равным 1:0,05...0,2:1,0...0,3 (по массе). Полученные препараты иммобилизованных холинэстераз обладают повышенной стабильностью (Т<SB POS="POST">1/2</SB>= 144-280 ч), а также удобными механическими свойствами, например фильтруемостью.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„Я0„„14725ОЗ А1 (д1) 4 С 12 Н 11/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

М Д ВТОРСМ0МУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ дят в смесь микродиизоцианата (на ос- (Д нове полиоксипропиленгликоля и 2,4толуилендиизоцианата) и воды, взятых ф .в соотношении соответственно 0,1

0,3:1:0,05 — 0,2 (по массе), тщательно перемешивают до образования пузырьков газа и отверждения. Полученные образы представляют собой мелкопористую эластичную губку, обеспечивающую высокую фильтруемость жидкости 0,018-0,079 мл/см с. Стабильг ность иммобилизованных ферментов значительно возрастает, так как время полуинактивации увеличивают до 144ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

f10 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4221321/31 — 13 (22) 01.04 ° 87 (46) 15.04.89. Бюл. Ь - )4 (71) Институт химических наук АН

КазССР (72) Б,А.Жубанов, П.П.Гладышев, С.А.Мошкевич, Ю.А.Шаповалов, Л.Б.Рухина, Р,А.Åñêàðàåâà и Е.О,Батырбеков (53) 577.15(088.8) (56) Богатский А.В ° Иммобилизация пектаваморина Г 10х включением в гель. — Прикладная биохимия и микробиология, 1979, т. 15, Р 5, с.747—

748.

Bauman Е.К., Goodson Н.L., Guilbault G.G., Kramer D.N., Preparation

of immobibized Cholinesterase for

use in Analytical Chemistry. — Analytical Chemistry, 1965, vol. 37, Р 11, р. 1378. (54 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОИ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ (57) Изобретение относится к биотехИзобретение относится к биотехнологии, а конкретно к способу получения иммобилизованных ферментов холинэстераз, которые могут быть использованы в аналитических системах и ферментных реакторах.

Цель изобретения — увеличение стабильности иммобилизованных холинэстераз.

Способ заключается в сорбционной и ковалентной иммобилизации ферментов на силохромах и последующем включе- нии в пепополиуретан. Иммобилизованные на силохроме холинэстеразы вво-. нологии и может быть использовано в сиг нализ а торах токсичности и анализаторах метаболитов, а также в ферментативных реакторах для синтеза ценных биоорганических препаратов.

Целью изобретения является увеличение стабильности иммобилизованных холинэстераз. Способ заключается в проведении ковалентного или адсорбционного связывания холинэстераз на силохроме с последующим введением силохрома со связанными ферментами в смесь воды и макродиизоцианата и перемешиванием гетерогенной системы до вспенивания и отверждения. Соотношение микродиизоцианат, воды и силохрома устанавливают равным 1:О, 1:0,05 — 0,2:1,0 — 0,3 (по массе).

Полученные препараты иммобилизованных холинэстераз обладают повышенной стабильностью (Т„ =144-280 ч), а также удобными механическими свойствами, например фильтруемостью..1472503

280 ч (по сравнению с 6-48 ч в из— веетном способе). . I3 р и м е р 1. Сорбция бутирилхолинэстеразы (БХЭ) на силохромах (СХ-1 и СХ-3).

Навеску силохрома 1,5 r в течение 2-3. ч уравновешивают в 10 мл

0,015 М фосфатного буферного раствора с рН=7,5, Затем буфер сливают и к носителю приливают 10 мл раствора фермента с удельной активностью

1,25 ед.мг. белка и концентрацией

1,0 мг/мл. Сорбцию проводят в течение 2 ч при постоянном перемешивании. По завершении сорбции силохром отфильтровывают и промывают фосфатным буферным раствором с рН=7:,5 от избытка фермента, Количество сорбированной бутирилхолинэстеразы определяют спектрофотометрическим методом при 280 ммк по разности концентраций фермента в растворе до и после сорбции. Полученный гетерогенный биокатализатор содержит 27,5 мг бутирилхолинэстеразы на 1 г носителя, удельная активность 1,15 ед/мг белка, Синтез уретанового форполимера (макродиизоцианата) проводят следующим образом, В трехгорлый реактор, снабженный мешалкой, термометром, трубкой для ввода аргона, помещают .полиоксипропиленгликоль (ПОПГ) (мм

1000) и добавляют к нему при энергичном перемешивании свежеперегнанный толуилендиизоцианат (ТДИ). Реакцыо проводят при 388-393 К в течение

1,5-2,0 ч в токе аргоне при соотношении ПОПГ:ТДИ=1,0:2,5. Окончание реакции определяют по процентному содержанию изоцианатных групп (NCO

6, 7- 6, 9g) . Полученный макродиизоцианат хранят в сухой, герметически закрытой посуде.

На фторопластовую подложку помещают 1 r уретановоrо форполимера, добавляют 0,15 r силохрома, содержащего сорбированную бутирилхолинэстеразу. Смесь тщательно перемешивают до получения однородной массы, затем прибавляют 0,1 r Н О, Перемешивание продолжают до начала выделения .пузырьков газа (СО ) и оставляют образец до полного вспенивания и отверждения, Полученная гетерогенная биосистема представляет собой мелкопористую высокоэластичную губку, содержащую 4,0 мг бутирилхолинэстеразы. Относигельная ак,тивность иммобилизованного биокатализатора, определенная электрохимическим методом равна 0,0016 ш А, а время полуинактивации (Т „, ) 144 ч. Измерения электрохимическим методом проводят на потенциостате П-2857, В качестве рабочего и вспомогательного используют

10 платиновые электроды, электродом сравнения служит насыщенный каломельный электрод. 0,015 М фосфатный буфер и 10 М раствор субстрата ацетил, — или бутирилтиохолинйодида из

IS сосудов перекачиваются при помощи многоканального перестальтического насоса в смеситель, затем в термоо статируемый реактор при t=37 С и смесь подается в колонку, заполнен20 ную носителем с иммобилизованным ферментом, На выходе из колонки продукты реакции поступают в проточную электрохимическую ячейку, подключенную к потенциостату П-2857(8).

25 Запись производят при помощи потенциометра, При прокачивании через ячейку буферного раствора регистрируется фоновый ток, соответствующий нулевой линии. При пропускании раст30 вора субстрата без фермента регистрируется малый остаточный ток. Подключение в системе колонки с иммобилизованным ферментом проявляется как характерный пик тока, величина которого зависит от количества образовавшегося продукта реакции. Последняя, в свою очередь определяется физиологической активностью иммобилизованной системы. Учитывая это, величина 40 пика тока может служить показателем относительной активности данной биокаталитической системы. Удельная активность препарата равна 1,10 ед/мг белка, фильтруемость 0,039 мл/см . с. Z

Пример 2. Иммобилизация бутирилхолинэстеразы на аминосилохроме при ковалентной "пришивке фермента к носителю.

К 0,3 r аминированного силохрома приливают 10 мл 27.-ного водного раствора глутарового альдегида и смесь интенсивно перемешивают в течение 10 мин. После окончания обработки носитель тщательно отмывают ат избытка диальдегида сначала водой, а затем фосфатным буферным раствором с рН=8,7. Регистрацию степени отмывки осуществляют спектрофотометричес2503 равно 280 ч. Удельная активность

0,39 ед/мл белка, содержание фермента 4,7 мг/г носителя, Пример 4. Ковалентное связывание ацетилхолинэстеразы на аминированном силохроме с последующим .введением биосистемы в пенополиуретан.

К 0,1 г аминосилохрома приливают

12 мл 2Х-ного водного раствора глутарового альдегида, Активацию сило50

5 147 ким методом при .длине волны 235 мк.

К обработанному глутаровым альдегидом силохрому приливают 10 мл раствора бутирилхолинэстеразы с концентрацией 1,7 мл/мл, и удельной активностью ),25 ед/мг белка, Ковалентную "сшивку" осуществляют в течение 2 ч при постоянном перемешивании. По окончании иммобилизации силохром отфильтровывают и промывают буфером от избытка фермента. Регистрацию бутирилхолинэстеразы осуществляют спектрофотометрическим методом при длине волны 280 ммк. Полученная гетерогенная биокаталитическая система содержит 26,0 мг белка на 1 г носителя с удельной активностью 1,18 ед/мг белка. Затем в форполимер, полученный по примеру 1, добавляют гетерогенный биокатализатор. . Иммобилизацию биосистемы завершают, добавляя при формировании пенополи-. уретана 0,05 г воды. Т< равно 150 ч его относительная активность составляет 0,0019 р А. Удельняя активность

1,13 ед/мг белка, содержание фермента 3,9 мг белка 1 r носителя. Фильтруемость 0,018 мл/см с.

Пример . 3. Сорбционная иммобилизация ацетилхолинэстеразы на силохроме.

Навеску сорбента 0,2 г уравновешивают в 10 мл 0,015 M фосфатного буферного раствора с рН=З,З в тече1 ние 2 ч. Затем носитель отфильтровывают, к нему приливают 5 мл раствора ацетилхолинэстеразы (АХЭ) с концентрацией 4,8 мг/мл и удельной активностью 0,45 ед/мг белка. Сорбцию проводят в течение 2 ч при постоянном перемешивании на качалке. После иммобилизации избыток фермента сливают, силохром промывают фосфатным буферным раствором с рН 3,3. Количество связавшейся ацетилхолинэстера-.. зы определяют по разности концентраций белка в растворе до и после сорбции. Регистрацию фермента осущестBJIHIoT спектрофотометрическим методом при длине волны 280 ммк, Полученный продукт содержит 31,1 мг ацетилхолинэстеразы на 1 r носителя с удельной активностью 0 41 ед/мг белка. Силохром с сорбционно связанным ферментом вводят в формполимер. Иммобилизацию завершают, добавляя 0,2 r H 0.

Фильтруемость 0,079 мл/см с.. Относи20

45 тельная активность иммобилизованного препарата, определенная электрохимически, составляет 1,17 р А, T„. хрома производят в течение 10 мин.

После обработки. носитель отфильтровывают и тщательно промывают сначала дистиллированной водой, а затем

0,015 М фосфатным буферным раствором с рН=5,5 с целью .удаления избытка диальдегида, К обработанному сило— хрому приливают 5 мл фосфатного 6y-. ферного раствора с pH=5,5. содержащего 4,8 мг/мл ацетилхолинэстеразы с удельной активностью 0,45 ед/мг белка, Ковалентную "сшивку" осуществляют в течение 2 ч при постоянном перемешивании на качалке. После иммобилизации избыток фермента отфильтровывают, силохром промывают фосфатным буферным раствором с pH=7,5.

Оценку количества связанного биокатализатора осуществляют в соответствии с примером 1. В результате ковалентной "сшивки" получают гетерогенную биокаталитическую систему, содержащую 80 мг ацетилхолинэстеразы на 1 г носителя с удельной активностью

0,42 ед/мг белка. Аминированный силохром с ковалентно "пришитой" АХЭ затем вносят в форполимер. Вспенивание и отверждение полученной биосистемы производят в соответствии с примером 1, добавляя лишь 0,15 мл воды.

Фильтруемость 0,056 мл/см с. Опредег ление активности иммобилизованной биосистемы, электрохимически показывает, что полученный гетерогенный биокатализатор обладает относительной активностью 1,23 р А, Т<,г равно

240 ч. Удельная активность АХЭ

0,41 ед/мг белка, содержание фермента 12 мг/г носителя.

Пример 5 (сравнительный).

Иммобилизацию АХЭ и БХЭ осуществляют по причеру 4, используя рН буферного раствора равного 5,5. В форполи.

1472503

55 мер добавляют 0,01 мл воды. Экспериментальные исследования показывают, что в следствие недостатка И О не происходит вспенивание форполимера.

Образовавшаяся биосистема получается в виде. монолитного материала— пленки (a не губки). Фильтруемость

0 мл/см

Пример . 6 (сравнительный).

1 .Проводят связывание АХЭ и БХЭ на аминированном силохроме. В процессе постановки эксперимента единственным отличием является введение в форполимер 0,005 r гетерогенного биоката" лизатора АХЭ (или БХЭ). Результаты исследований показывают практическое отсутствие физиологической активности иммобилизованной биосистемы, Пример 7 (сравнительный).

Иммобилизацию АХЭ и БХЭ осуществляют согласно примера 1. Отличительным

" признаком примера является введение в форполимер 0,5 г силохрома. Исследования показывают, что избыток силохрома забивает поры пенополиуретана, и образовавшая биосистема обладает плохой фильтруемостью.

Пример 8 (сравнительный). Согласно примера 1 осуществляют иммобилизацию АХЭ и БХЭ на силохромах.

При иммобилизации ферментов применяют буферный раствор с рН=2;О. Установлено, что иммобилизованные биосистемы не проявляют физиологической активности вследствие инактивации ферментов.

Пример 9 (сравнительный).

По примеру 3 проводят иммобилизацию

АХЭ и БХЭ, При иммобилизации ферментов и в процессе определения физиологической активности используют

0,015 М фосфатный буферный раствор с рН=9,4. Установлено, что при данном рН происходит растворение носителясилохрома.

Пример 10. Иммобилизацию проводят по примеру 1, изменяя,соотношение компонентов микродиизоцианат.;вода:силохром до 1:0,25:0,15.

Фильтруемость 0,097 мл/см с.

Предложенное в способе соотношение введенной воды (0,05-0,2) обус-. ловлено следующим. Минимальное количество Н О (0,01) приводит к получению монолитного материала у пленки, не обладающим признаком фильтруемости. Максимальное количество воды (О;25) приводит к образованию биокатализаторов с такой высокой степенью фильтруемости, что проходящий через ферментный реактор субстрат не успе-. вает прореагировать с ферментом.

Предложенный диапазон (0,1-0,3) введенного силохрома с иммобилизованным ферментом обусловлен следующими причинами. Введение в пенополиуретан гетерогенного катализатора менее

0,1 показывает отсутствие физиологической активности системы, а введение более 0,3 г силохрома с иммобилизованным ферментов приводит к полус чению системы, обладающей плохой фильтруемостью, поскольку избыток силохрома забивает поры пенополиуретана.

При использовании в примере 1 силохрома в СХ-1 и СХ-3 получены идентичные результаты.

Таким образом, использование данного способа позволяет получить препараты иммобилизованных холинэстераз с более высокой стабильностью со временем полуинактивации 144-280 ч . вместо 6-48 ч в известном способе.

При этом силохром и ферменты, включенные в массу пенополиуретана в процессе его получения не вымываются из иммобилизованной системы элюируемыми растворами субстратов. Полученные иммобилиэованные системы обладают хорошими технологическими характеристиками, выраженными в высокой степени фильтруемости гетерогенных биокатализаторов. Совокупность положительных свойств иммобилизованных биосистем дают возможность использовать их в сигнализаторах токсичности и анализаторах метаболитов, а также в ферментных реакторах для синтеза биопрепаратов.

Ф о р м ул а.и з о б р е т е н и я

Способ получения иммобилизованной холинэстеразы, заключающийся во включении холинэстеразы в пористый пенополиуретан, полученный на основе макродиизоцианата, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью увеличения стабильности целевого продукта, холинэстеразу предварительно адсорбируют или ковалентно связывают с силохромом, а включение полученной связанной холинэстеразы в порис1472503!

Составитель В.Муронец

Редактор И.Сегляник Техред 3I.Сердюкова Корректор В.Романенко

Заказ 1674/28 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãoðîä, ул. Гагарина, 101 тый пенополиуретан ведут в процессе .его образования путем перемешивания макродиизоцианата, воды и силохрома со связанной холинэстеразой в соотношении 1:0,05 — 0,2:О,1 — 0,3 (по массе) до вспенивания и отверждения.