Способ конструирования вектора pvm061

 

Изобретение относится к области биотехнологии ,в частности, к генетической инженерии, и касается конструирования плазмидного вектора для выражения экзогенных генов в трансформированных штаммах бактерий E.COLI. Целью изобретения является получение авторегулируемого стимулируемого вектора. Функциональные элементы данного вектора состоят из липопротеинового гена E.COLI фрагмента стимулируемого промотора LAC - промотора E.COLI, фрагмента ДНК для репрессора, который содержит целый функциональный ген LAC 1 E.COLI, а целевой полипептид выражается в трасформантах E.COLI. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (191 (11) (5ц 4 С 12 N 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К IlATEHTV

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР (21) 3597101/28-13 (22) 12. 05.83 (31) 378481 (32) 14.05 ° 82 (33) US (46) 07.05.89. Бюл. - 17 (71) Дзе Рисерч Фаундейшн оф Стейт

Юниверсити оф Нью-Йорк (US) (72) Масаери Иноуйе, Кензо Накамура и Есихиро Масуи (JP) (53) 575.224.2.577.2(088,8) ,(56) Патент США Р 4349629, кл. С 12 N 15 /00, 09.04.82.

Патент Франции Р 2442271, кл. С 12 N 15/00, 28.07.80. (54) СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ ВЕКТОРА

pVN061

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и касается конструирования плазмидного вектора для . выражения экзогенных генов в трансформированных штаммах бактерий Е.coli.

Целью изобретения является получение авторегулируемого стимулируемого вектора.

Функциональные элементы данного вектора состоят из липопротеинового гене Е.coli., фрагмента стимулируемого промотора — 1ас-промотора Е.coli фрагмента ДНК для репрессора, который содержит целый функциональный ген 1acl

Е. coli, а целевой полипептид выражается в трансформантах Е.coli (57) Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и касается конструирования плазмидного вектора для выражения экзогенных генов в трансформированных штаммах бактерий Е.coli

Целью изобретения является получение авторегулируемого стимулируемого вектора. Функциональные элементы данного вектора состоят из липопротеинового гена Е.coli фрагмента стимулируемого промотора lас-промотора Е.coli фрагмента ДНК для репрессора, который содержит целый функциональный ген

lас I E.coli, а целевой полипептид выражается в трансформантах Е.coli.

1 табл.

Пример 1. 2 мкг ДНК плазмиды р S С101 переваривают до конца двумя единицами ограничительной эндонуклеазы

Есо RI в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 100 ммоль/л трис-НС1 (рН 7,5)

75 ммоль/л 11аС1, 6 ммоль М@С1

6 ммоль/л -меркаптоэтанола и

100 мкг/мл бычьего сывороточного альо бумина (БСА) буфером Есо RI при 37 С в течение 60 мин. Чтобы предотвратить самолегирование ДНК р S C101, обработанной Есо RI, добавляют бактериальную щепочную фосфатазу (BAP) (0,1 ед.

Worthing to BAPF) и инкубирование о продолжают в течение 60 мин при 37 С.

Реакцию заканчивают фенольнай экстракцией, и линиаризованные ДНК выде-. ляют этанольным осаждением.

14 7900-

Фрагмент ДНК длиной 2,8 тыс. оснований, содержащий липопротеино вый ген Е. cali, получают отдельно из гибридного -фага, несущего липопротеиновый ген Е. со11 (обозначенный как

g lрр Гс-I) . Липопротеиновый ген предварительно клонируют в % -фаговый вектор 3540 следующим обр,.зом: всю

ДНК (200 мкг), выделенную из штамма

К-12 E. coli, меродиплоидного для липопротеинового гена (Те 5519/F 506) переваривают с 200 ед, ограничительного фермента Hind III. Фрагменты

ДНК разделяют на препаративном ага5 розном геле и собирают фракции фрагментов ДНК длиной примерно 0 тыс. оснований, ко торые проя вляют положи—

I тельную гибридизацию с 5 -32р-липои ро теино вой и-P H K, при использовании южного способа гибридизации. Смесь фрагментов Hind III длиной 10 тыс. оснований (обогащенную примерно в двадцать раз) и расщепленной Hind III

Ъ 540.векторной ДНК контактируют с 15

Т4 ДНК-лигазой. Легированную ДНК используют для трансфекции Е. co li К302, NRRI В-15016. Рекомбинантные фаги, несущие липопротеиновый ген, отбирают с помощью зонного способа гибриди- 30

l з ации, при, и споль з о вании 5 -3 2р-лип опротеино.вой и-PHK. Было найдено, что одна из исследованных зон, дающая по-. ложительную гибридизацию, несет полный функциональный липопротеиновый ген, и ее обозначили как $ lрр Ес-1.

Двести микрограммов ДНК Q 1рр Ес-1 полностью переваривают с 200 ед. ограничительного фермента Нае III в 40

500 мкл реакционной смеси, содержащей

6 ммоль/л трис-НС1 (рН 7,5), 6 ммоль/л 1gC1< ммоль/л NaC1, 6 ммоль/л — меркаптоэтанола и

100 мкг/мл. бычьего сывороточного 45 альбумина (буфером Нае III) .при

37 С в течение 2 ч, и фрагмент Нае III длиной 2,8 тыс. оснований, несущий липопротеиновый ген Е ° coli, очищают .фракционированием на 5%-ном полиакриламидном геле по следующей методике. Сначала реакционную смесь экстра— гируют фенолом, а затем фрагменты

ДНК осаждают 2,5 объемами этанола, сушат под вакуумом, растворяют в

200 мкл буфера, содержащего 5% глицерина, 20 ммоль/л ЭДТА, 0,5% бромофенола голубого и 0,05% ксилолцианола (эту смесь называют гелевым бу— фер ом) и после э то гo фр акционируют на 5%-ном полиакриламидном геле. Ho— лоску Д11К, которая мигрировала в положение 2,8 тыс. оснований, вырезают из геля и фрагменты ДНК элюируют из геля электрофорезом. Краситель бромистый этидий, используемый для локализации полосы ДНК в геле, удаляют из фрагментов ДНК фенольной экстракцией, Фрагменты ДНК осаждают 2,5 объемами этанола, центрифугируют, растворяют в 200 мкл 0,3 м/л ацетата натрия, повторно осаждают 0,5 мл этанола и снова сушат под вакуумом.

Выделяют примерно 10 мкг очищенного фрагмента Нае III длиной 2,8 тыс. оснований.

Для того, чтобы клонировать фрагмент Нае 111 длиной 2,8 тыс. оснований в pS С101, синтетические молекулы Есо Rl связки присоединяют к концам фрагмента Нае 111 длиной 2,8 тыс., з оснований. Связку Есо RI (5 ГГААТТЦЦ фосфорилируют Т4 палинуклеотидной киназой вместе с АТФ в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 3 моль связки, 66 ммоль/л трис — НС! (рН 7,5), 10 ммоль/л NgC1, 1 0 ммоль/л /3-меркаптоэтанола, 60 мкмоль/л АТФ и

10 ед. 74 полинуклеотидной киназы. о

После инкубирования смеси при 37 С в течение 30. мин, ее нагревают при

60 С в течение 10 мин и охлаждают до

37 С ° Пять мкл 0,1 моль/л -меркаптоэтанола и 10 ед. Т4 полинуклеотидной киназы добавляют к смеси и реако цию продолжают при 37 С в течение

30 мин. Реакцию останавливают путем замораживания смеси в бане из сухого льда-э танола.

Фрагмент Нае 111 длиной 2,8 тыс. оснований (2 мкг) смешивают со

15 0 пмол ь фо сфорилир о в анной с вяз ки

Есо RI и обрабатывают 4 ед. Т4 ДНК лигазы в 12,5 мкл реакционной смеси, содержащей 66 ммоль/л трис-НС1 (рН

7,5), 10 ммоль/л NgC1, 10 ммоль/л дитиотреитола (лигазным буфером) и

О

0,6 ммоль/л АТФ при !2,5 С в течение

15 ч. Реакцию останавливают путем разбавления смеси в двадцать раз с помощью буфера Есо RI и путем нагревао ния смеси при 60 С в течение 10 мин °

Добавляют тридцать единиц ограничительного фермента Eco RI и смесь инкубируют при 37 С в течение одного часа, чтобы получить цепкие концы

Eco RI Реакцию останавливают путем

79004 6

5 l4 нагревания смеси при 60 С в течение

10 мин, Покрученную таким образом смесь до— бавляют к 2 мкг предварительно линеаризованной gHK плазмиды pS C101 и осуществляют фенольную экстракцию, После экстракции эфиром ДНК осаждают этанолом, высушивают под вакуумом и растворяют в !00 мкл лигазного буо фера. Смесь нагревают при 37 С в течение 5 мин, и цепкие концы Есо RI ренатурируют путем инкубирования при

4 С в течение 16 ч, а затем при О С о D в течение одного часа. После добавления АТФ (0,4 ммоль/л конечная концентрация) и 1 ед. Т4 ДНК-лигазы смесь инкубируют при 12, 5 С в течение 7 ч.

Четвертую часть легированной смеси используют после этого для трансформации мутанноro штамма ТЕ5527 с липопротеиновой делецией Е.coli

NRRL В-15012, Проводят трансформацию и трансформанты резистентные к тетрациклину выращивают в течение ночи на фильтровальной бумаге Ватман

ЗМИ, помещенной на поверхности L бульонной чашки, содержащей 10 мкг/мл тетрациклина, и отбирают липопротеиновые клоны путем гибридизации колоний. Фрагмент МБр 1 длиной 0,95 тыс. оснований 9,1рр Ес-1, содержащий липопротеиновьгй ген, подвергают меченой трансляции с (-32 р! d АТФ и (1-32pj

d ЦТФ и его используют как р-зонд, Было показано, что один из трансформантов, дающих положительную гибридиз ацию, содержит. плазмиду со структурой и эту плазмиду обозначают

pKEN III. Эту плазмиду получают из

Е.coli, CC620/pKEN III, NRRI-В-15011.

Плазмиду можно получить из NRRI-В15011 обычным способом, Родительской плазмидой, выбранной для конструкции плазмиды, выражающей липопротеиновый ген, была pBR 322 (молекулярный вес примерно 2,6 мега- дальтонов), несущая гены резистентности к ампициллиновым (Amp) и те тр аци клин о вым а н ти био тик ам ..

pBR 322 включает сайт расщепления

Есо RI, расположенный на 5 конце гена тетрациклино вой резистентности, а также сайт расщепления Hind III, находящий ся в промо торе гена тетрациклиновой резистентности, и сайт отщепления Pvu I, находящийся в гене ампициллиновой резистентности.

-5

Для того, чтобы клоннровать фрагмент Alu I длиной 462 пары основаьпн, содержащий участок липопротеинового промотора в pBR 322, первоначально проводят делецию фрагмента ДНК, лежащего между сайтами отщепления Есо

RI u Hind III p8R 322 (содержащими промотор гена тетрациклиновой резистентно сти), используя следующую методику: 11 мкг ДНК плазмиды pBR 322 переваривают 11 ед. ограничительной эндонуклеазы Hind III в 200 мкл реакционной смеси, содержащей 10 ммоль/л трис-НС1 (рН 7,5), 10 ммоль/л ИяС1

60 ммоль/л, NaC1, 6 ммоль/л.

Р --Меркаптоэтанол и 100 HKr/iUi бычьего сывороточного апьбумина буо фера Hind III переваривают при 37 С в течение одного часа, После окончания переваривания проводят фенольную экстракцию и ДНК выделяют этанольным осаждением. Чтобы удалить цепкие концы Hind III, ДНК обрабатывают

1,5 мкл SI нуклеазы (IIiles 1.аЬэга оries) в конечном объеме 300 мкл буфера, содержащего 30 лыоль/л ацетата натрия (рН 4, 25), О, 3 моль /л NaC1 и

4 ммоль /л ZnS04 буфера S I при 20 С в течение одного часа. Реакцию оста- навливают путем добавления 30 мкл

500 ммоль/л трис-НС1 (рН 8,0) и

30 мкл 250 ммоль/л ЭДТА, после чего проводят фенольную экстракцию. Чтобы удалить фенол, смесь экстрагируют эфиром и диализуют против 0,01" ББС (ББС=0,15 ИаС1+0,015 цитрата натрия) при 4 С в течение ночи и ДНК удаляют. этанольным осаждением.

Затем добавляют фосфорилированную связку Есо RI (200 мкмоль) и смесь обрабатывают 4 ед. Т4 ДНК вЂ” лигазы в

12,5 мкл лиг азного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ при 12,5 С в течение 16 ч. Цепкие концы Есо RI помещают в 75 мкл буфера Eco RI npu

37 С в течение 2 ч. Реакцию останавливают путем фенольной экстракции и

ДНК выделяют этанольным осаждением.

Цепкие концы Есо RI легируют и плазмиду повторно зажимают путем обработки с 0,3 ед, Т4 ДНК лигазы в

20 мкл лигазного буфера, содержащего

0,4 ммоль/л АТФ при 12,5 С в течение

7 ч, Апиквоту 0,5 мкг легированной

ДНК используют для трансформации штамма JE5519, Е. coli NRRI В-15013/

F-, aroD, шап, argE, lac, gal, rpsL, дугА, гесА1. Десять трансформантов, 1479004 которые быпи резистентны к ампициллину, чувствительны к тетрациклину, выращивают в течение ночи в 1 мл бульона Ь, содержащего 50 мкг/мл ампициллина. Плазмидные ДНК выделяют из

0,5 мл культур способом быстрой щелочной денатурации и их анализируют картированием с помощью ограничительного фермента. Выделяют плазмиду рКЕ N005.

Фрагмент Alu 1 из 462 пар оснований, содержащий липопротеиновый промотор, получают следующим образом: 100 мкг

ДНК плазмиды р KEN III переваривают с ограничительным ферментом ИБр 1 в

600 мкл буфера, содержащего

10 ммоль/л трис-НС1 (рН 7,5), 10 ммоль/л И@С1<, ммоль/л КС1, 1 ммоль/л дитиотреитола и 100 мкг/мп бычьего сывороточного альбумина (эту 20 смесь называют буфером Нра 1), при о

37 С в течение 3 ч. После экстракции фенолом фрагменты ДНК осаждают 2,5 объемами этанола, сушат под вакуумом, растворяют в 10 мкл гелевого буфера 25 и фракционируют на 57.-ном полиакриламидном геле. Примерно 6 мкг очищенного фрагмента MSp I длиной 0 95 тыс. оснований переворачивают затем с ограничительной эндонуклеазой Alu I 30 в 400 мкл .буфера Hind III при 37 С в течение 2 ч,.получив фрагмент Alu Т длиной 462 пар оснований, который очищают гель-электрофорезом.

Один микрограмм фрагмента Alu I длиной 462 пар оснований затем смеши. вают со 150 пмоль фосфорилированной связки Есо RI и обрабатывают 4 ед.

Т4 ДНК-лигазы в 10 мкл лигазного буфера, содержащего О,б ммоль/л АТФ 40 при 12,5 С в течение 16 ч. Легированную ДНК переваривают с 40 ед. ограничительного фермента Есо RI в 100 мкл буфера Есо RI при 37 С в течение одного часа, чтобы создать цепкие кон- 45 цы Есо RI, Переваривание останавливают путем нагревания смеси при о

60 С в течение 10 мин и к смеси добавляют 0,6 мкг переваренной Есо RI

ДНК-ппазмиды pKEN 0,05 и проводят фенольную экстракцию. ДНК выделяют этанольным осаждением и цепкие концы

Есо RI соединяют путем обработки

0,4 ед. Т4 ДНК-лигазы в 20 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л о

Э

АТФ при 12,5 С в течение 7 ч. Легированные ДНК используют для трансформации штамма JE5519E coli NRRL В-15013 и траноформанты отбирают на тетрациклиновую резистентность на чашке с буI льоном L, содержащим 1 2, 5 мкг /мл тетрациклина. Анализ плазмидной ДНК, выделенной из резпстентных к тетрациклину трансформантов способом быстрой щелочной денатурации, показывает вставку фрагмента Alu I длиной 462 пар оснований в сайте Есо R pKEN

005, и полученную таким образом одну из плазмид обозначают рКЕИ 008.

Следующей стадией конструирования клонируемых вектор-носителей А сайта липопротеинового гена было исключить один из двух сайтов отщепления Есо

RI в p KEN 008. Это необходимо для того, чтобы гарантировать единственную точку для вставления для экзогенного гена, выбранного для клонирования, сразу же ниже фрагмента Alu I и длиной 462 пар оснований (фрагмент

Eco RI), содержащего промо тор липопротеинового гена и 5 — непереводимый уча сто к.

4 мкг переваренной Есо RI ДНК плазмиды pBR 322 обрабатывают сначала SI нуклеазой, чтобы удалить цепкие концы Есо RI, а затем бактериальной щелочной фосфотазой, чтобы пр .— дотвратить самолегирование. Затем

ДНК смешивают с 0,76 мкг очищенного фрагмента Alu I длиной 462 пар оснований (полученного из PKEN III) и легируют тупые концы с 2,4 ед. Т4

ДНК-лигазы в 10 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ при 12,5 С в течение 16 ч. Половину легированной

ДНК используют для трансформации штамма JE 5519 Е.coli NRRL В-15013, один из трансформантов содержит плазмиду. Эту плазмиду обозначают АКЕН

002 и после переваривания 25 мкг ДНК плазмиды pKEN 002 с ограничительными ферментами Pvu I и ХЬа I в 500 мкл буфера, содержащего б ммоль/л трисНС1 (pH 7,9), ммоль/л Hg Clz

150 ммоль/л NaC1, 6 ммоль/л Р-меркаптоэтанола и 100 мкг /мл бычьего сывороточного альбумина (указанную смесь о называют буфером Bam HI), при 37 С в течение одного часа очищают гельэлектрофорезом фрагмент ДНК длиной

1,04 тыс. оснований Pvu I-Xba I. Фрагмент ДНК длиной 24 пары оснований

Xba I-Eco RI получают из pKEN 008 следующим образом: 25 мкг ДНК плазмиды рKEN 008 переваривают с ограничительным ферментом Есо RI длиной

470 пар оснований очищают гель-элект1479004

40 рофорезом. Один микрограмм фрагмента

Есо RI длиной 470 пар оснований затем переваривают с ограничительным ферментом Xba I и смешивают с одним микрограммом фрагмента ДНК длиной

1,04 тыс. оснований Pvu I — ХЬа, по— лученным ранее, а также с 075 микрограммами ДНК плазмиды pKEN 005, предварительно переваренной с ограничительными фермента ш Pvu I и Есо RI.

Смесь ДНК обрабатывают 0,8 ед. Т4

ДНК-лигазы в 50 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л АТФ при

12,5 С в течение 7 ч.

Полонину легированной ДНК исполь— зуют для трансформации штамма JE

5519, Е. coli, NRRLÂ-15013 и выбирают трансформанты, чувствительные к тетрациклину. Анализируют плазмидную

ДНК, полученную из 0,5 мл культуры трансформантов, чувствительных к тетрациклину, способом быстрой щелочной денатурации и выделяют плазмиду ркка 010. 25

Фрагмент Есо RI длиной 2,8 тыс. оснований получают из ДНК плазмиды

pKEN III путем переваривания с ограничительным ферментом Есо RI с последующим фракционированием на полиак- 30 риламидном. геле и 10 мкг этого очищенного фрагмента полностью переваривают с ограничительной эндонукпеазой .

Pvu II в 500 мкл буфера Нае 111 при о

37 С в течение диого часа. Реакцию 35 останавливают посредством фенольной экстракции и смесь экстрагируют эфиром. Фрагменты ДНК осаждают 2,5 объемами этанола, подвергают центрифугированию, повторно растворяют в

200 мкл 0,3 моль/л ацетата натрия и повторно осаждают с помощью 0,5 мл этанола. Пять микрограмм переваренного Pvu II фрагмента Есо RI длиной

2, 8 ты с. оснований смешивают с 45

390 пмоль фосфорилированной связки

Ham HI и легируют тупые концы с 6 ед.

Т4 ДНК-лигазы в 25 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ при 12,5 С в течение 16 ч. Реакционную смесь разбавляют до 150 мкл с помощью буфера Нае 111 и нагревают при 60 С в течение 10 мин, чтобы дезактивиро вать Т4 ДНК-лигазу. После добавления 60 ед. ограничительного фермента Нае 111 смесь инкубируют при 37 С в течение одного часа. о

Поскольку использованная здесь связка Bam HI имела последователь-ность оснований 5 ЦЦГГЛТЦЦГГ, последовательность узнавания для огра— ничительного фермента 1(ае 111

5 ГГЦЦ ЦЦГГ создавалась в месте сое3 динения двух любых фрагментов

3 ЦЦГГ5 связки. Таким образом, при использовании указанного ограничительного фермента Нае 111 для переваривания легированных связ кой Bam HI фрагментов Pvu III (эти фрагменты не содержат внутренних сайтов отщепления Нае II) осуществляют удаление излишних множественных фрагментов связки 8am HI, связанных с концом

Pvu II, при этом остается только один такой фрагмент связки,,непосредственно присоединенный к этому концу. Эта процедура сильно упрощает очистку фрагмента ДНК, содержащего

3 конец липопротеинового гена.

После дезактивации фермента Нае 111 путем нагревания реакционной смеси о при 60 С в течение 10 мин фрагменты

ДНК полностью переваривают с ограничительным ферментом Нра ) в 400 мкл о буфера Нра 1 при 37 С в течение 2 ч.

Реакционную смесь экстрагируют фенолом и фрагменты ДНК осаждают этанолом, сушат под вакуумом, растворяют в 100 мкл гелевого буфера и фракционируют на 5Е-ном полиакриламидном геле. Полосу ДНК, которая мигрировала в положение 0,95 тыс. оснований, вырезают из геля, и фрагменты

ДНК элюируют из геля электрофорезом, После удаления красителя бромистого этидия с помощью фенольной экстракции, фрагменты ДНК осаждают 2,5 объемами этанола, центрифугируют, растворяют в 200 мкл 0,3 моль/л ацетата натрия, повто рно осаждают с помощью

0,5 мл этанола и снова сушат под вакуумом. Выделяют примерно один мкг очищенного фрагмента Нае 111-Нра 1 длиной 0,95 тыс. оснований .

Сто двадцать пикомолей фосфорилизI рованной связ ки Sal I (5 ГГТЦГАЦЦ ) смешивают с 0,75 мкг очищенного фрагмента Нае 111-Нра 1 длиной 0,95 тыс. оснований и тупые концы легируют с

3,5 ед. Т4 ДНК вЂ” лигазы в 25 мкл лигазного буфера, содержащего

0,6 ммоль/л АТФ при 12,5 С в течение 16 ч. Реакционную смесь разбавляют достаточным количеством Bam HI буфера, чтобы получить конечный объем

300 мкл, а затем смесь нагревают при о

60 С в течение 10 мин. Добавляют дос1479004

12 таточные количества ограничительных ферментов Bam HI u Sal I и смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч, чтобы получить цепкие концы путем отщепления связок Bam HI u Sal Е, присоединенных к концам Pvu II и Нра I со— ответственно, в результате чего по— лучают фрагмент Bam HI — Sal I длиной

0,95 тыс. оснований . Переваривание ограничительной эндонуклеазой оста-; о . навливают путем нагревания при 60 С в течение 10 мин.

На этой стадии половину объема смеси (150 мкл), содержащей примерно

0,38 мкг фрагмента Bam HI-Sal I длиной О, 95 тыс. оснований, смешивают с одним микрограммом ДНК-плазмиды

pKEN 014, которую предварительно переваривают с ограничительными ферментами Bam HI u Sal I и обрабатывают бактериальной щелочной фосфотазой. Плазмиду pKEN 014 предварительно получают из pBR 322 путем делеции фрагмента Hind III - Bam HI длиной 25

346 пар оснований (содержащего большую часть гена тетрациклиновой резистентности) из рВК 322. Этот фрагмент удаляют, чтобы свести до минимума размер выражаемой плазмиды (примерно 30

5 тыс. оснований). Делецию этого фрагмента проводят путем переваривания Hind III с последующей обработкой нуклеазой SI в течение одного часа при 20 С, после чего присоединяют о связку Bam HI полностью переваривают Ваш HI повторно циклиз уют с помощью Т4 ДНК-лигазы и выбирают транс— форманты, чувствительные к тетрациклину .. 40

Смесь линеаризованной ДНК-плазмиды

pKEN 014 и фрагментов Ваш HI — Sal длиной 0,95 тыс. оснований экстрагируют фенолом, и .ДНК осаждают 2,5 объемами этанола подвергaloT центрифуги 45 рованию и растворяют в 200 мкл

0,3 моль/л ацетата натрия. ДНК повторно осаждают с помощью 0,5 мл этанола, центрифугируют и сушат под вакуумом. Цепкие концы фрагменто в ДНК

50 ренатурируют с помощью 0,4 ед. Т4

ДНК-лигазы в 60 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л АТФ при

12,55 С в течение 7 ч. Двенадцать микролитров легированной смеси з атем используют для трансформации штамма

JE 5519, Е.coli NRRL В-15013, и двенадцать резистентных к ампициллину трансформантов выращивают в течение ночи в одном миллилитре бульона L, содержащим 50 микроорга низмо в /мп ампициллина. Плазмидные ДНК выделяют из 0,5 мл культур способом быстрой щелочной денатур ации и анализируют агароз ным гель-электрофор ез ом. Было найдено, что лять плазмидных ДНК несут фрагмент Bam HI - Sal Е длиной

0,95 тыс. оснований и одну из этих плазмид обозначают pKEN 018.

Следующая стадия при ко нструировании клонируемых вектор-носителей

А-сайта липопротеинового гена заключается в том, чтобы соединить фрагмент липопротеинового промотора с фрагментом окончания транскрипции в одинаковой ориентации. Эту стадию осуществляют, з аменяя фрагмент Pvu IEco RI длиной 630 пар оснований

pKEN 018 фрагментом Pvu I-Eco RI длиной 1,1 тыс. оснований плазмиды

pKEN 010.

Чтобы это осуществить, 20 мкг

ДНК-плазмиды pKEN 010 полностью переваривают с ограничительной эндонуклеазой Pvu I в 100 мкл буфера Bam HI о при 37 С в течение 1,5 ч. После дезактивации фермента Pvu I посредством нагревания реакционной смеси при

60 С в течение 10 мин, добавляют

52 мкл воды, 40 мкл 0,5 моль/л трисНС1 (рН 7,5), 4 мкл 0,1 моль/л МяС1 и 40 ед. ограничительного фермента

Есо RI. Реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение одного часа и пео реваривание о стана вливают феноль ной экстракцией. Фрагменты ДНК осаждают

2,5 объемами этанола, сушат под вакуумом, растворяют в 100 мкл гельного. буфера и фракционируют на 57-ном полиакриламидном геле. После элюирования отдельных фрагментов ДНК из геля получают четыре микрограмма очищенных фрагментов Pvu I-Eco RI длиной 1,1 тыс. оснований.

Очищенный фрагмент (0,75 мкг) затем смешивают с 0,6 мкг ДНК-плазмиды pKEN 018, которую предварительно подвергают двойному перевариванию с ограничительными ферментами Pvu I и Есо RI а затем обработкой бактериальной щелочной фосфотазой. Цепкие концы Pvu I и Есо RI легируют путем обработки с 0,4 ед. Т4 ДНК-лигазы в

50 мкп лигазного буфера, содержащего о

0,4 ммоль/л АТФ при 12,5 С в течение

7 ч. Двадцать пять микролитров легированной смеси используют для транс! 479004

5

55 формации штамма JE 5519 E. coli

НКВД В-15013 и отбирают трансформанты, с.тойкие к ампициллину. Плазмидные

ДНК выделяют из резистентных к ампициллину трансформантов и их анализируют с помощью агарозного гель-электрофореза, Отбирают плазмиду pKEN

021.

pKEN 021 несет как фрагмент липопротеинового промотора, так и фрагмент окончания липопротеиновой транс— крипции, которые разделены фрагментом длиной 32 пары оснований, получены из pBR 322. Посредством делеции последнего фермента и вставки последовательно сти ДНК, кодирующей целевой полипептид, обеспечивается функциональная группа для выражения целевого полипептида. Однако в силу тоro, что на концах фрагмента длиной 32 пары о с но ва ний н аходя т ся сай ты о тщепления

Есо RI u 8am HI, структура плазмиды

pKEN 021 допускает только вставку вставочных фрагментов экзогенной ДНК, имеющих цепкие концы Есо RI-Есо RI, Bam HI-Ram НЕ или Есо RI-8am HI. Поэтому, чтобы расширить класс экзогенных генов, которые можно вставлять, чтобы они включали гены, сшиваемые с другими сочетаниями цепких концов, последовательность ДНК на этом участке можно модифицировать и добавить сайт расщепления Hind III между существующими сайтами Есо RI u Bam HI, Для достижения этого сначала желательно уменьшить размер плазмиды, исключив фрагмент Hind III-С1а I длиной 200 пар оснований в pKEN 021 с помощью следующей методики: пять микрограммов ДНК плазмиды pKEN 021 час— тично переваривают с одной единицей ограничительного фермента Cia I в

1-0 мкл реакционной смеси, содержащей 10 ммоль/л трис-НС1 (рН 8,0), 10 ммоль/л И8С1 и 100 мкг/мп бычьего о сывороточного альбумина, при 37 С в течение одного часа. После фенольной экстракции и этанольного осаждения цепкие концы С1а 1 удаляют посредством обработки с 600 ед. нуклеазы SI в 200 мкл буфера SI при 20 С в течение одного часа. Реакцию останавливают путем добавления 20 мкл

0,5 моль/л трис-НС1 (рН 8,0) и

20 мкл 0,25 моль/л ЭДТА. Смесь экстрагируют фенолом и диализуют в течение четырех часов против 0,01 SSC, ДНК осаждают 2,5 объемами этанола, центрифугируют и по втор но су сп ендируют в 100 мкл 0,3 моль/л ацетата натрия. ДНК повторно осаждают 250 мкл зтанола, центрифугирувт и высушивают под вакуумом.

Затем один микрограмм обработанной

SI ДНК смешивают с 70 пмолями фосфо рилированной связки Ндпт1 111 (5 ЦЦААГЦТТГГ ) и легируют тупые концы 4 ед. Т4 ДНК-лигазы в 20 мкл лигазного буфера, содержашего

0,6 ммоль/л АТФ при 12,5 С в течение

16 ч. Затем смесь разбавляют до

100 мкл с помощью буфера Hind III и нагревают ее при 60 С в течение о

10 мин. Добавляют двадцать единиц ограничительной эндонуклеазы Hind III, о > смесь инкубируют при 37 С н течение одного часа, чтобы удалить избыточные молекулы связки и получают цепкие концы Hind III, Затем реакционную смесь экстрагируют фенолом и ДНК осаждают этанолом. Плазмидные ДНК (0,5 мкг) повторно циклизуют посредством обработки с 0,8 ед. Т4 ДНК-лигазы в 15 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л АТФ при 12,5 С в течение 7 ч. Восемь микролитров легированной смеси используют для трансформации штамма Та221 Е. coli, NRBL В-15014 /recA, hr, h, b, trpE5, thr, leu, thi, lacY

Чтобы исключить сайт отщепления

Hind III pKEN 030, 2,5 мкг ДНК-плазмиды pKEN 030 переваривают с 5 ед. ограничительного фермента Hind III в 50 мкл буфера Hind III при 37 G в течение одного часа. После фенольной экстракции и осаждения этанолом цепкие концы Hind III удаляют путем обработки 400 ед. нуклеазы SI в

200 мкл буфера SI при 20 С в течение одного часа. После выделения ДНК, 0,75 мкг обработанной SI ппазмидной

ДНК повторно циклизуют посредством обработки 2 ед. Т4 ДНК-лигазы в

10 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ, при 12,5 С в течение 16 ч. Три микролитра легиро-. ванной смеси используют затем для трансформации штамма ТА221 Е. coli, NRRL В-15014, и выделяют плазмиду рKEN 033, которая не содержала сайтов отщепления Hind III.

Последовательность ДНК-плазмиды

pKEN 033 модифицируют, чтобы создать сайт отщепления Hind Ш между сайтами Eco RI u Bam HI следуюшим обра15

1479004 зом: 5 мкг ДНК-плазмиды pKEN 033 переваривают с 10 ед, ограничительной эндонуклеазы Ваш HI в 50 мкл буфера о

Bam HI при 37 С в течение одного ча5 ca После дезактивации фермента

Bam HI путем нагревания реакционной о смеси при 60 С в течение 10 мин линеаризованные фрагменты Д! .К переваривают с 10 ед. фермента Eco PI в о

100 мкл буфера Есо RI при 37 С в течение одного часа После фенольной экстракции и осаждения этанолом, ДНК (3,6 мкл) обрабатывают тремя единицами Т4 ДНК полимеразы в 20 мкл 15 реакционной смеси, содержащей

50 ммоль/л трис-НС1 (pH 8,0), 100 ммоль/л КС1, 6 ммоль/л,jC1 и

6 ммоль/л дитиотреитола (эту реакционную смесь называют полимеразным эфером) в присутствии 0,1 ммоль/л каждого из соединений.с1АТФ, dGTP, ЙСТР и с1ТТР при 12,5 С в течение

45 мин, После выделения ДНК добавляют 25

30 пмолей фосфорилизированной связки Hind III, после чего проводят тупоконечное легирование 4 ед. Т4

ДНК-лигазы в 15 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ, при 30 о

12,5 С в течение 16 ч. Затем смесь разбавляют до IOO мкл с помощью буфера Hind III и переваривают со

100 ед. ограничительного фермента

Hind III. Смесь инкубируют при 37 С в течение одного часа, чтобы удалить избыточные молекулы связки и получить цепкие концы Нхnd III, которые потом соединяют (при этом повторно циклизуют плазмидные ДНК) посредством об- 4р работки 0,8.мкг ДНК 0,4 ед. Т4 ДНКлигазы в 20 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л АТФ при

12,5 С в течение 7 ч. После трансформации штамма ТА221 Е. coli, NRRL

В-15014 с помощью части легированной смеси плазмидные ДНК выделяют из резистентных, ампициллину колоний и плазмиду обозначают pKEN 037, Анализ нуклеотидной последовательности

ДНК pKEN 037 показал, что в последовательности ДНК имеется делеция одной

Г-Ц пары между сайтами отщепления.

Hind III u Bam HI (по неизвестным причинам). и pKEN 037 представляет со- 5 бой структурный А-1 клонируемый вектор-носитель.

Для того, чтобы согласовать вставочные фрагменты ДНК с рамками считывания, отличными от рамок pKEN 037, конструируют клонируемые вектор-носители А-2 и А-3 липопротеинового гена посредством регулирования рамок считывания pKEN 030 в сайте отщепления Есо RI, Эта последовательность включает сайт отщепления Alu I между положениями +45 и +46 При .получении плазмиды pKEN 008 связку

Есо RI присоединяют к концу Alu получая последовательность ДНК в плазмидах pKEN 008, pKEN 010, pKEN

021 и pKFN 030 и получая сайт отщепления Есо RI между положениями +47 и +48, Последовательность ДНК pKEN

030 модифицируют в сайте Есо РI, чтобы сдвинуть ее рамку считывания на одно и на два основания .соответственно, Чтобы добиться этого результата в первом случае и получить плазмиду с рамкой считывания А-2, 5 мкг ДНКплазмиды pKEN 030 полностью переваривают с ограничительным ферментом

Есо RI в 100 мкл буфера Есо RI npu о

37 С в течение 60 мин. После фенольной экстракции и этанольного осаждения ДНК обрабатывают 3 ед. Т4-полимеразы в 30 мкл полимеразного буфера в присутствии 0,1 ммоль/л dGTP H

0,1 ммоль/л dATP при 12,5 С в течение

45 мин. Реакцию останавливают путемдобавления ЭДТА до конечной концентрации

25 ммоль/л. После чего проводят фенольную экстракцию. Таким образом половину 4-основных Есо RI "цепких концов" заполняют двумя А-остатками.

Остальные два однонитчатых А-остатка удаляют посредством обработки нуклеазой SI в 200 мкл буфера SI при 20 С в течение одного часа, Реакцию останавливают путем добавления 20 мкл

0,5 моль/л трис-НС1 (рН 8,0) и 20 мкл

0,25 моль/л ЭДТА. Смесь экстрагируют фенолом и диализуют в течение ночи против 0,01 » SSC. ДНК осаждают

2,5 объемами этанола, центрифугируют и повторно суспендируют в 100 мкл

0,3 моль/л ацетата натрия. ДНК повторно осаждают с помощью 250 мкл этанола, центрифугируют и сушат под вакуумом.

Чтобы восстановить сайт отщепления Eco RI, один микрограмм обработанной SI ДНК сначала смешивают с

70 пмолями фосфорилированиой связки

Есо RI и тупоконечно легируют с

3,2 ед. Т4 ДНК-лигазой в 11 мкл лигазl7

l8

1479004 ного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л о, АТФ при 12,5 С в течение 16 ч. Затем смесь разбавляют до 50 мкл буфером Есо RI и нагревают при 60 С в течение 10 мин, Добавляют двадцать единиц ограничительной эндонуклеазы

Есо RI и смесь инкубируют при 37 С в течение одного часа, чтобы удалить избыточные молекулы связки и получить цепкие KOHIIbl Eco RI. Затем реакционную смесь экстрагируют фенолом, и ДНК осаждают этанолом. Плазмидные

ДНК (0,5 мкг) повторно циклизуют посредством обработки с 0,8 ед. Т4

ДНК-лигазы в 15 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л АТФ, при 12,5 С в течение 7 ч. Восемь микролитров легированной смеси используют для трансформации штамма ТА221

Е. coli, NRRL В-15014. Плазмидные

ДНК очищают из 3 трансформантов резистентных к ампициллину, которые выращивают в течение ночи в .100 мл бульона L, содержащего 50 мкг/мл ампициллина, определяют последовательности ДНК в их сайтах отщепления Есо RI, выделяют плазмиду и обозначают pKEN 024 (А-2).

Чтобы сконструировать плазмиду с рамкой считывания А-3 5 мкг ДНКплазмиды рКЕН 030 полностью переваривают с ограничительным ферментом

Есо RI в 100 мкл буфера Fco RI npu

37 С в течение 60 мин. После фенольнои экстракции и этанольного осаждения "цепкие концы" Eco PI удаляют посредством обработки ДНК (4,4 мкг), 500 ед. куклеазы БТ в 150 мкл буфера

SI при 20 0 в течение одного часа, Реакцию останавливают путем добавления 15 мкл 0 5 моль/л трис-НС1 (pH 8,0) и 15 мкл 0,25 моль/л ЗДТА.

Смесь экстрагируют фенолом и диализуют в течение четырех часов против

0,01 » SSC. ДНК осаждают с помощью

2,5 объемов этанола, центрифугируют и повторно суспендируют в 100 мкл

0,3 моль/л ацетата натрия. ДНК повторно осаждают 250 мкл этанола, центрифугируют и высушивают под вакуумом.

Чтобы восстановить сайт отщепления Есо RI, один микрограмм обработанной SI ДНК смешивают с 240 пмолями фосфорилированной Есо RI связки и легируют тупые концы с помощью 4 ед.

Т4 ДНК-лигaзы в 15 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ при

35 40

12,5 Г в течение 16 ч. Затем смесь разбавляют до 250 мкл буфером Есо К? о и нагревают при 60 С в течение 10 мин

Добавляют сто единиц ограничителей эндонуклеазы Есо PI и смесь пнкубируют при 37 С в течение одного часа, чтобы удалить избыточные молекулы связки и получить цепкие концы Есо РТ

Затем реакционную смесь экстрагируют фенолом и ДНК осаждают этанолом.

Плазмидные ДНК (0,3 мкг) повторно циклизуют посредством обработки

0,8 ед. Т4 ДНК-лигазы в 15 мкл лигазного буфера, содержащего 0,5 ммоль/л

АТФ, при 12,5 С в течение 7 ч, Восемь микролитров легированной смеси используют для трансформации штамма ТА221

Е. coli, NRRL В-15014. Плазмидные

ДНК очищают из 3 трансформантов, ре— зистентных к ампициллину, которые выращивают в течение ночи в 100 мл бульона L, содержащего 50 мкг/мл ампициллина, и после этого определяют последовательности ДНК в их сайтах отщепления Есо RI. Была выделена плазмида, которую обозначают pKEN

036 (А-З).

Чтобы изменить трансляционную рамку считывания pKEN 037 (0-1) на две другие рамки считывания (А-2 и А-3), меньший фрагмент ХЪа I — Есо RI

pKEN 037 заменяют меньшими фрагментами ХЪа I — Есо Rl из pKEN 024 (А-2) или из pKEN 036 (А-3), 3 мкг pKEN 037 сначала переваривают с 6 ед. ограничительного фермента ХЪа I в 50 мкл буфера Bam HI при 37 C в течение одного часа, а после дезактивации фермента ХЬа I фрагменты линеаризованной

ДНК переваривают с 6 ед. ограничительного фермента Есо RI в 100 мкл буфера Есо RI при 37 С в течение одного часа. Больший фрагмент Xba I—

Есо RI отделяют от меньшего фрагмента посредством агарозного гель-электрофореза, фрагменты ДНК в агарозном геле красят бромистым этидием (один мкг/мл) и вырезают полосу, соответствующую большему фрагменту. Фрагменты ДНК в этой полосе элюируют из геля после замораживания. Бромистый этидий удаляют из фрагментов ДНК фенольной экстракцией и ДНК выделяют этанольным осаждением.

Высушенные фрагменты IIHK растворяют в 20 мкл воды и аликвоты в один микролитр смеси этого фрагмента ДНК

pKEN 037 смешивают с 0,1 мкг каждого

19

1479004

35 из меньших ограничительных фрагментов

Xba I — Есо RI предварительно полученных из pKEN 024 или pKEN 036 путем двойного переваривания каждой плазмиды ограничительными ферментами Xba I

5 и Есо RI с последующей гелевой очисткой. Цепкие концы" фрагментов

ХЬа I — Есо RI соединяют путем обработки 0;2 ед. Т4 ДНК-лигазы в 20 мкл лигазного буфера, содержащего

0,4 ммоль/л АТФ, при 12,5 С в течение

7 ч после чего часть легированной смеси используют для трансформации штамма ТА221 Е. coli,. NRRL В-15014.

Среди резистентных к ампициллину трансформантов получают плазмидные

ДНК, имеющие рамки считывания A-2 и

А-3 1их обозначили pKEN 039 и pKEN

040 соответственно), 20

Указанное представляет собой экспериментальную методику, которую используют в первом случае для конструирования плазмиды pKEN 039 (А-2) и

pKEN 040 (А-3) . 25

В частности, последовательность

ДНК в окрестности сайта отщепления плазмиды pKEN 037 (А-1) изменяют, чтобы непосредственно получить структуру плазмиды pKEN 039 (А-2) или 30

pKEN 040 соответственно, Первая стадия при конструировании

В-сайтовых выражаемых плазмид заклю- . чается в конструировании плазмиды, служащей источником фрагментов липопротеинового гена и имеющей сайт .отщенления ограничительного фермента вблизи сайта отщепления сигнального пептида. Выбранный ген кодирует липопротеин S. marcescens и имеет 40 последовательность узнавания Fnu

4Н-1 ограничительной эндонуклеаэы на 3 -конце сигнального пептида,Быl ла выбрана плазмида pBR 322 для приема липопротеинового гена S. marces- 45

cens.

2 мкг ДНК-плазмиды pBR 322 переваривают до конца с двумя единицами ограничительной эндонуклеазы

Bam HI в 50 мкл буфера Bam HI npu

37 С в течение 60 мин. После дезако, тивации фермента Bam HI посредством нагревания при 60 С в течение 10 мин добавляют 2 ед. Есо RI и 100 мкл буфера Eco RI. Затем смесь инкубируют при 37 С в течение 60 мин, а реакцию останавливают фенольной экстракцией, после чего фрагменты линеаризованной

ДНК выделяют этанольным осаждением, т рагмент ДНК длиной 8, 5 ты с, оснований, содержащий липопротеиновый ген S. marcescens, выделяют отдельно из гибридного $ -фага, несущего липопротеиновый ген S. marcescens (обозначенный Ъ 1ppSm-1), Липопротеиновый ген предварительно клонировали в вектор ?т-фаг Charon 14 следующим образом. Всю ДНК (200 мкг), выделенную из S. marcescens, переваривают с

200 ед. ограничительного фермента

Есо Р.I. Фрагменты ДНК разделяют на препаративном агарозном геле и собирают фракции фрагментов ДНК длиной примерно 8,5 тыс. оснований, которые проявляют положительную гибридизацию

I с 5 32 р липопротеиновой и-РНК в южном способе гибридизации. Смесь фрагментов Есо RI длиной 8,5 тыс, оснований (обогащенную примерно в двадцать раз) и отщепленной Есо RI векторной

ДНК Charon 14 обрабатывают Т4 ДНК-лигазой, Легированную ДИК используют для трансформации IIITGMMa K802 E. coli, NRRL В-15016. Рекомбинантные фаги, несущие липопротеиновый ген, высевают способом зонной гибридизации Бентона и Дэвиса, используя

5 P-липопротеиновую и-РНК. Одну из 12 изученных зон, которая дала положительную гибридизацию, обозначают как

31ppSm-1.

Два микрограмма gHK 91ppSm-1 затем полностью переваривают с.ограничительными ферментами Ватп НТ. и Eco RI таким .же образом, как и в отношении линеаризации pBR 322, и 0,5 мкг фрагментов ДНК QlppSm-1смешивают с

0,5 мкг предварительно линеаризованной ДНК плазмиды pBR 322 в 40 мкг лигазного буфера. Смесь нагревают при 37 С в течение 5 мин и цепкие концы Fco RI H Bam VI ренатурируют инкубированием при 4 Г в течение

16 ч, а затем при 0 С в течение 1 ч.

После добавления АТФ (конечная концентрация 0,4 ммоля/л) и 0,4 ед, Т4

ДНК-лигазы смесь инкубируют при

12,5 С в течение ? ч, Четвертую чдсть легированной смеси используют после этого для трансформации мутантного штамма ТЕ5527 с липопротеиновой делецией Е. cali

NRRL В-15012. Трансформацию проводят и резистентные к амт;ициллину трансформанты выращивают в течение ночи на фильтровальной бумаге Ватман ЗИМ, помещенной на поверхность бульона

22

21

1479004

55 содержащего 50 мкг/мп ампициллина, и отбирают липопротеиновые клоны путем гибридизации колоний, Фрагмент

Msp I длиной 0,95 тыс, оснований

) 1рр Ес-1, содержащий липопротеиновый геп, подвергают меченной трансляции с (oL-32p) dATP и (Ы;32р) dCTP u его используют в качестве р-зонда, Было получено, что один из трансформантов, который дает положительную гибридидацию, содержал плазмиду (эту плазмиду обозначают рКЕ14 221).

Чтобы сконструировать В-сайтовые клонируемые вектор-носители, фрагмент Fnu 4Н-1 длиной 329 пар оснований, содержащий липопротеиновый npot мотор и 5 -непереводимый участок, а также участок сигнального пептида липопротеинового гена S. marcescens клонируют н pKEN 0,005 следуюшим образом: 80 мкг ДНК-плазмиды pKEN 221 переваривают до конца со 100 ед. ограничительной эндонуклеазы Fnu 4Н-1 в 400 мкл буфера Нае III и фрагмент

Fnu 4Н-1 длиной 324 пары оснований очищают электрофорезом на акриламидном геле.

Поскольку переваривание ограничительного фермента Fnu 4Н-1 приводит к образованию фрагментов с цепкими концами на обоих концах, эти цепкие концы заполняют Т4 ДНК полимераэой, чтобы получить тупые концы. Два микрограмма очищенного фрагмента Fnu

4Н-1 длиной 324 пары оснований обрабатывают 3 ед. Т4 ДНК полимеразы в

20 мкл полимеразного буфера в присутствии 0,1 ммоль/л каждого из

dATP, dGTP, dCTP u dTTP при 12,5 С в течение 45 мин. После фенольной экстракции и этанольного осаждения фрагменты ДНК смешивают с 400 пмолями фосфорилированной связки Eco RI и обрабатывают 4 ед. Т4 ДНК-лигазы в 20 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ, при 12,5О С в течение 16 ч. Смесь разбавляют до

300 мкл буфером Есо RI и переваривают с .150 ед. ограничительного фермента Fco RI, чтобы получить цепкие концы Есо RI.

Один микрограмм обрабатывают

Есо RI фрагментом, затем смешивают с 0,5 мкг обработанной Eco RI ДНКплазмиды рКЕМ 005 и обрабатывают смесь 0,4 ед. Т4 ДНК-лигазы в 40 мкл лигазного буфера, содержащего

0,6 ммоль/л АТФ, при 12,5" G н тече5

40 ние 16 ч, Двадцать мнкролитров легированной смеси используют для трансформации штамма ТГ 5519 F.. coli, NRRL

В-15013. При анализе ограничительным ферментом плазмидной ДНК, полученной из резистентных к тетрациклину трансформантов способом быстрой щелочной денатурации, выясняют, что плазмида несет фрагмент Есо RI длиной 344 пар оснований, полученный иэ фрагмента Fnu 4Н-1 длиной 329 пар оснований (эту плазмиду обозначают

pKEN 009). Анализ нуклеотидной последонательности ДНК-плазмиды pKEN 009 показывает,. что сайт Есо RI H pKEN

099 находится в В-нстаночном сайте и соответствует рамке считывания

В-1, По причинам, которые н настоящее время не ясны, три пары оснований нставлены н участок в положении

+90 (что принело к добавлению одного лишнего аминокислотного остатка в этом положении) и лишняя пара Г-Ц вставлена в положение +99, Удивительным кумулятинным эффектом этих изменений было превращение аминокислотной последовательности на участке сайта отщепления сигнального пептида из соответствующего участка липопротеинового гена S. marcescens в соответствующий участок липопротеинот ного гена Е. coli.

Чтобы сконструировать В-сайтоные выражаемые плаэмиды, соответствующие рамкам считывания В-2 н В-3, исключа. ют один из двух сайтон отщепления

Есо КТ рКЕИ 009. Этот способ включает перенос фрагмента ХЬа I - -Eco

RI длиной 80 пар оснований (содержащего сигнальный пептид и часть 5 — непереводимого участка липопротеинового гена 8. marcescens) из рКЕЯ 009 в сайты Xba I — Есо RI pKEN 010, Для осуществления этого 5 мкг ДНК плазмиды pKEN 010 сначала переваривают с 5 ед. ограничительной эндонукле- . азы ХЬа Т в 50 мкл 6y4>cpa Bam HI, после чего переваривают с 5 ед. ограничительного фермента Есо Ri в 100 мкг буфера Eco RI. Затем линеаризованную

ДНК обрабатывают 5 мкг бактериальной щелочной фосфотазы н 100 мкл

10 ммоль/л трис-НС1 (рН 8,0) и

0 1 ммоль/л ЭДТА при 37 С в течение

30 мин. Плаэмидные ДНК экстрагируют фенолом и осаждают этанолом и 0,5 мкг

ДНК смешивают с 0,2 мкг фрагмента

ХЬа I — Есо RI длиной 80 пар основа23

1479004 ний, который получили предварительно путем переваривания 50 мкг ДНК-плазмиды pKEN 099 ограничительными ферментами Есо R и ХЬа I, после чего проводят электрофорез полиакриламидного геля. Смесь ДНК обрабатывают 0,4 ед.

Т4 ДНК-лигазы в 40 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммсчь/л АТФ о

1 при 12,5 С в течение 16 ч. Двадцать микролитров легированной смеси используют для трансформации штамма

ТЕ5519 Е. coli, NRRL В-15013. При ограничительном ферментативном анализе плазмидных ДНК, полученных иэ резистентных, к ампициллину трансформантов способом быстрой щелочной денатурации находят, что одна плазмида содержит нужный фрагмент Xba I — Eco RI длиной 80 пар оснований, несущий

20 участок сигнального пептида липопротеинового гена S. marcescens в рамке считывания В-1 (эту плазмиду обозначают pKEN 017).

Рамку считывания в В-вставочном 25 сайте в РЕЕМ 017 затем модифицируют, чтобы получить плазмиды, соответствующие рамкам считывания В-2 и В-З, в соответствии с описанными способами изменения рамки считывания А-1 на рам-30 ки считывания А-2 или А-3 соответственно. Те же способы, которые используют для получения плазмид pKEN 024 (А-2) и РКЕМ 036 (А-3) из плазмиды

pKEN 030 (А-1), можно также испольэовать для получения плазмид pKEN 026 (В-3)и pKEN 037 (В-2) из плазмиды

pKEN 017 (В-1).

Последняя стадия конструирования сайтовых векторов заключается в за- 40 мене А-сайтового фрагмента pKEN 037

Xba I — Есо RI одним из трех различных В-сайтовых фрагментов ХЬа IEco RI pKEN 017, pKEN 026 и pKEN 027, \

Это нужно для того, чтобы получить 45

В-сайтовые плазмиды с такими же последовательностями узнавания ограничительных ферментов Есо RI, Hind III и Bam HI во вставочном сайте экзогенной ДНК, какие имеются в А-сайте плазмид, Каждый из трех В-сайтовых фрагментов, полученных из pKEN 017

pKEN 026 и pKEN 027, содержит последовательность ДНК, включающий сигнальный пептид, полученный из фрагмента

Fnu 4Н-1 липопротеинового гена S, marcescens.

Для достижения этого используют такую же методику получения большего фрагмента Xba I — Есо RI плазмиды pKEN 037, Аликвоты в один микролитр водной смеси фрагмента ДНК

pKEN 037 смешивают ио отдельности с различными меньшими фрагментами

Xba-I — Есо RI (примерно 0,1 мкг каждого), предварительно полученными иэ pKEN 017, pKEN 026 и pKFN 027 соответственно путем двойного переваривания с ограничительными ферментами ХЬа Т. и Есо RI с последующей гелевой очисткой. Каждую смесь ДНК обрабатывают 0,2 ед, Т4 ДНК-лигазы в 20 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л АТ@, при 12,5 С в течение 16 ч, Десять микролитров каждой легированной смеси используют для трансформации штамма ТА221 Е. coli NRRL В-15014. Из резистентных к ампициллину трансформаторов очищают плазмидные ДНК, имеющие рамки считывания В-1, В-2 и В-3, и их обозначают pKEN 041, pKEN 047 и pKEN 048 соответственно.

Чтобы сконструировать С-сайтовые клонируемые вектор-носители, фрагмент

Sau ЗА длиной 193 пары оснований, содержащий липопротеиновый промо-! тор и 5 -непереводимый участок, а также участок. сигнального пептида и первые восемь структурных кодонов липопротеинового гена Е, coli сначала клонируют в pKEN 005 следующим образом: 200 мкг ДНК-плазмиды pKEN 111, полученной обычным образом из Е, co-li CC620/pKEN III, NRRL В-15011, переваривают до конца с 200 ед. ограничительной эндонуклеазы Sau ЗА в

400 мкл реакционной смеси, содержащей 10 ммоль/л трис-НС1 (рН 7,5), 10 ммоль/л MpCl, 60 ммоль/л NaC1 и

100 мкг/мл бычьего сывороточного альо бумина, при 37 С в течение одного часа, После окончания переваривания проводят фенольную экстракцию, ДНК выделяют этанольным осаждением и фрагмент Sau ЗА длиной 193 пары оснований очищают электрофорезом акриламидного геля, !

Поскольку переваривание ограничи-. тельного фермента Sau ЗА приводит к образованию фрагментов с цепкими концами на обоих концах, эти цепкие концы заполняют Т4 ДНК-полимеразой, чтобы получить тупые концы. Два микрограмма очищенного фрагмента Sau ЗА длиной 193 пары основания обрабатывают 3 ед. Т4 ДНК-полимеразы в 20 мкл

26

25 !

479004

30 полимеразногo буфера 73 присутствии

О, 1 ммоль/л каждого из dATP, dGTP, с1СТР и dTTP при 12,5 С в течение

45 мин. После фенольной экстракции и этанольного осаждения фрагменты ДНК

5 смешивают с 400 пмолями Аосфорилировянной связки Есо RI и с брабятывают

4 ед. Т4 ДНК-лигязы в 20 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л

АТФ, при 12,5 С в течение 16 ч. Смесь разбавляют до 300 мкл буфером Есо КТ и переваривают с 150 ед. ограничительного фермента Eco RI, чтобы получить цепкие концы Eco RI. 15

Один микрогрямм обработанных

Есо RI фрагментов затем смешивают с

0,5 мкг обработанной Есо RI ДНК-плазмиды pKEN 005 и обрабатывают полученную смесь 0,4 ед. Т4 lIHK-лигазы в 20

40 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ, при 12,5 С в течение 16 ч. Двадцать микролитров легированной смеси используют для трансформации штамма ТЕ5519 Е. coli, NRRL 25

В-15103, При ограничительном ферментативном анализе плазмидных ДНК, полученных из реэистентных к тетрациклину трансформантов способом быстрой щелочной денатурации, выявляют, что одна из плазмид несет фрагмент

Есо RI полученный из фрагмента Sau

ЗА длиной 193 пары оснований, и эту плаэмиду обозначают pKEN 006. Анализ нуклеотидной последовательности .ДНКплаэмиды рКЕИ 006 показал, что сайт

Eco RI u pKFN 006 находится в С-вставочном сайте и соответствует рамке считывания С-l.

Чтобы сконструировать.С-сайтовые 40 выражаемые плазмиды, соответствующие рамкам считывания С-2 и С-3, сначала исключают один из двух сайтов отщепления Есо RI u pKEN 006, Этот способ содержит пеРенос фрагмента Xba I

Есо RI длиной 106 пар оснований (содержащего сигнальный пептид, часть

5 непереводимого участка и часть

| структурной последовательности липопротеинового гена F.. coli) от

pKEN 006 в сайты ХЬа Т вЂ” Есо RI u

pKEN 010, Дпя осуществления этого 5 мкг

ДНК-плазмиды pKEN 010 переваривают с

5 ед. ограничительной эндонуклеазы

Xba I в 50 мкл буфера Ватп HI, после

I чего переваривают с 5 ед ограничительного фермента Есо к? в 100 мкл буфера Fco RI. Затем линеяризованную

Jl1IK обрабатывают 5 мкл бактериальной щелочной фосфятязы в 100 мкл

10 ммоль/л трис-НС1 (pll 8,0) и о

О, 1 ммсль/л ЭДТЛ пр«87 0 н течение

30 мин, Плазмидные ДllК смешивают с

0,2 мкг фрагмента ХЬа I — Fco RI длиной 106 пяр оснований, который предварительно получают путем переваривания 50 мкг ДНК-плазмиды pKEN 006 пграничительными ферментами Есо К1 и

ХЬа I с последующим электрофорезом полиякрилямидного геля. Смесь ДНК обрабатывают 0,4 ед. Т4 ДНК-лигазы в

40 мкл лигазного буфера, содержащего о

04 ммоль/л АТФ, при 12,5 С в течение

7 ч. Двадцать микролитров легированной смеси используют для трансформации штамма ТЕ5519, Е ° coli, 11КЮ.

 †150. При ограничительном ферментативном анализе плазмидных ДНК, полученных из резистентных к ямпициллину трансформантов cnîñîáoì быстрой щелочной денятуряции, находят,что одна плазмида содержит нужный фрагмент Xba I — Есо PI длиной 106 пар оснований, несущий участок сигнального пептида липопротеинового гена

Е. cali в рамке считывания С-1 и эту плазмиду обозначают pKEN 007, Рамку считывания в С-вставочном сайте в pKEN получить плазмиды, соответствующие рамкам считывания С-2 и С-3, согласно описанным способам изменения рамки считывания А-1 на рамки считывания

А-2 или А-3 соответственно.

Способы, которые используют для получения плазмид pKEN 024 (А-2) и

pKEN 036 (А — 3) из плазмиды pKEN 030 (А-1), можно использовать для получения плазмид pKEN 046 (С-2) и

pKEN 019 (С-3) из плазмиды pKEN 007 (С-1).

Последняя стадия конструирования

С вЂ” сайтовых выражаемых плязмид заключается в использовании каждого из трех различных фрагментов С-сяйтя

ХЪа I — Есо RI pKEN 007, pKEN 046 и pKEN 019 вместо фрагмента А сяйта

Xba I — Есо RI pKEN 037. Это делают для того, чтобы С-сайтовые плазмиды содержали те же последовательности узнавания ограничительных ферментов

Есо RI, Hind ПТ и Ham HI, кяк и плаэ-. миды А-сайта и В-сайта. Каждый из трех С-сайтовых фрагментов, полученных из pKEN 007, pKEN 046 и pKFN 019, содержит последовательность ДНК, вклю27

1479004

28 чающую сигнальный пептид, полученный из $ац ЗА фрагмента липопротеинового гена Е. coli.

Аликвоты в один микролитр водной смеси фрагментов ДНК pKEN 037 смешива5 ют по отдельности с различными меньшими фрагментами ХЬа I — Есо RI (примерно 0 1 мкг каждый), предварительно полученными из pKEN 007, pKEN 046 и pKEN 0,19 соответственно посредством двойного переваривания с ограничительными ферментами Xba I и Есо RI с последующей гелевой очисткой, Каждую смесь ДНК обрабатывают 0,2 ед. 15

Т4 ДНК-лигазы в 20 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л АТ, при 12,5 С в течение 16 ч, Десять микролитров каждой легированной смеси используют для трансформации штамма

ТА221 Е. coli, NRRL В- 15014. Из резистентных к ампициллину трансформантов выделяют плазмидные ДНК, имеющие рамки считывания С-1, С-2 и С-3 и их обозначают pKEN 042, pKEN 043 и 25

pKEN 044 соответственно.

Пример 2. Лак uv 5 промотороператор получают из плазмида рОР2033. Лак uv 5 промотор-оператор получают из штамма Е. coli 4288 rec 30

А/рКМ006, >ЖИ. В-15017. Лак uv 5 промотор-оператор. переносят на фрагменте

ХЬа I длиной 95 пар оснований плазми-. ды рКУ 006, Плазмиду получают обычным образом из NRRL В-15017 и после

3 этого известными способами выделяют .фрагмент ХЬа I длиной 95 пар оснований.

Лак uv 5 промотор-оператор вставляют в сайт отщепления ХЬа I pKEN 037 40 (в 5 -непреводимый участок липопротеинового гена) следующим образом:

200 мкг ДНК-плазмиды рОП203-3 переваривают до конца с 200 ед, ограничительного фермента Alu 1 в 400 мкл бу- 45 фера Hind III, и очищают электрофорезом полиакриламидного геля фрагмент

Alu I длиной 95 пар оснований, несущий участок лак ич 5 промотора и оператора, Один микрограмм фрагмента

Alu I длиной 95 пар оснований смешивают с 400 пмолями фосфорилированной (ХЬа Т фосфорилированной связки (5

ЦТЦТАГАГ ) и легируют тупые концы с

5 ед. Т4 ДНК-лигазы в 20 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л

АТ@, при 12,5 С в течение 16 ч, Легированную смесь разбавляют до .300 мкл буфером Bam HI и нагревают при

60 Г в течение 10 мин. Затем смесь обрабатывают 100 ед. ограничительного о фермента ХЪа I при 37 С в течение одного часа, чтобы получить цепкие концы ХЬа I. Смесь экстрагируют фенолом, осаждают этанолом и лиофилизируют.

Зятем фрагменты ДНК растворяют в

10 мкл воды и 0,3 мкг полученного таким образом лак-фрагмента смешивают с

0,5 мкг ДНК-плазмиды рКЕИ 037, которую предварительно переваривали с ограничительным ферментом ХЬа I.

Смесь обрабатывают 0,4 ед, Т4 ДНКлигазы в 20 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л АТЬ, при

12,5 С в течение 16 ч, чтобы ренатурировать ХЬа I цепкие концы, посредством чего повторно циклизуют плазмиду. Десять микролитрон легированной смеси используют для трансформации Е. coli ТА221/" lac 11, NRRL В-15015, который конструируют

I путем переноса F, фактора от X90/

F 1ас 1" lас рго+.

/ +

При ограничительном ферментативном анализе плазмидных ДНК из резистентных к ампициллину трансформантов crioсобом быстрой щелочной денатурации выявляют, что одна из. них содержит одну копию фрагмента Alu Е длиной

95 пар оснований, вставленную в сайт

Xba I pKEN 037 в правильной ориентации и эту плазмиду обозначают

pKEN 038, Чтобы упростить конструкцию, стимулируемых плазмид, содержащих В и

С вставочные сайты, удаляют один из двух сайтов отщепления Xba I в pKEN

038, окружающих фрагмент лак-промотора-оператора, Сайт отщеплепия ХЬа I, расположенный выше фрагмента лакпромотора-оператора, исключают. Это осуществляют, используя тот факт, что присоединение связки ХЬа Т к фрагменту лак-промотора-оператора длиной

95 пар оснований приводит к появлению нового сайта отщепления sst I только на конце лак-промотора, расположенного выше, а не ниже, Последовательность узнавания ограничительного фермента SSt I перекрывается с аналогичной последовательностью фермента

Xba I. Таким образом, делеция 4-основного цепкого конца сайта отщепления SSt I с помощью нуклеазы S I приводит к делеции части последовательности узнавания Xba I, что равносиль1479004

35

Но эффективному исключению сайта отщепления ХЬа I.

Для достижения этого пять микрограммов ДНК плазмиды pKEN 038 переваривают с 10 ед. ограничительной эн5 донуклеазы ЯБ Т в 50 мкл буфера

Ham HI и обрабатывают 500 ед. нуклеазы S I в 200 мкл буфера S I npu

20 С в течение одного часа. Тупые концы соединяют путем обработки

0,5 мкг обработанной S I ДНК 5 ед, Т4 ДНК-лигазы в 10 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТ>, при 12,5 С в течение 16 ч. tlÿòü микро 15 о литров легированной смеси используют для трансформации штамма ТА221/

F 1ас 1 Г. coli, NRRL В-15015 ° По1 сле проведения ограничительного ферментативного анализа плазмидных ДНК, 20 полученных из резистентных к ампициллину трансформантов способом быстрой щелочной денатурации, находят плазмиду, которую обозначают pKEN

045 (pIN-II А-1). 25

Существует несколько способов кон— струирования pIN-II плазмид, соответствующих рамкам считывания А-А и А-3.

Полагая доступность плазмид pTN-I

А-2 и А-З, в одном способе вставляют 30 фрагмент лак-промотора-оператора в плазмиды pKEN 039 и pKEN 040 в связи с плазмидой рКЕИ 037, В альтернативном и предпо тительном способе переносят меньшие .фрагменты Xba I—

Есо RI pKEN 039 и pKEN 040 в сайт

ХЬа I — Есо RI плазмиды pKF. .l 045, получают плазмиды pKEN 049 (pIN-II, А-2) и pKEN 050 (pIN — II, А-З).

Последовательность ДНК в окрест- 40 ности сайта отщепления Есо RI pKEN

045 модифицируют, чтобы непосредственно получить структуру плазмид pKEN

049 (А-2) или pKEN 050 (А-3), соответственно. Это наиболее предпочтитель-45 ный способ конструирования этих плазмид, поскольку для него не нужно предварительно конструировать соответствующие структурные плазмиды.

Полагая что уже сконструированы соответствующие pIN-I плазмиды, каждую из них можно модифицировать, чтобы вставить фрагмент лак-промотораоператора либо, что более предпоч— тительно, можно меньший фрагмент

Xba I — Есо RI pKEN 045 (pIN-II,А-1) последовательно заменить меньшими фрагментами Xba I — Fco RI из каждой из структурных плазмид В-сайта и С сайта, что дает в любом глучае pIN-Il плаэмиды согласно таблице

1 амка считы вания

Встаяочный сайт

Плазмплы

p IN т

Плазмидь.

pIN-II

pKFN 051

pKEN 052

pKEN 053

КEN 054

pKEN 055

pKEN 056

pKEN 041

pKFN 047

pKEN 048

pKFN 042

pKFN 043

pKFN 044

Наиболее предпочтительно конструировать pIN II выражаемые плазмиды без предварительного получения соответствующих pIN-I плазмид. В случае вставочноro сайта В плазмиду pKEN 051 (pIN-II, В-1) получают из плазмиды

pKEN 221 сначала путем переваривания

ДИК плазмиды pKFN 221 ограничительным ферментом Fnu 4H-1, а затем путем присоединения цепких концов Есо RI к концам полученного фрагмента в соответ. ствии с описанным способом, Полученный таким образом фрагмент Есо RI переваривают ограничительным ферментом Xba I, расщепив фрагмент на два в сайте расщепления Xba I, находящемся в 5 -непереводимом участке. Очищая полученный таким образом меньший фрагмент ХЬа I — Есо RI и используя его вместо меньшего фрагмента

Xba l — Есо RI pKFN 045 (pIN-IT, А-1), получают В-1 стимулируемый клонируемый вектор-носитель. Полученную плазмиду pKEN 051 (pIN-ТI, В-1)затем модифицируют, чтобы получить

pIN-тТ плазмиды, соответствующие рамкам считывания В-2 и В-З, pKEN 052 и рКЕИ 053 соответственно.

Аналогичным путем можно следовать чтобы получить pIN — II плазмиды С-сайта непосредственно без первоначально10 конструирования соответствующих

pIN-I.ïëàçìèä. После переваривания

ДНК плазмиды рKEN-III orpaничительным ферментом Sau ЗА и присоединения цепких концов Есо RI к концам полученного фрагмента полученный таким образом фрагмент Есо RI переваривают ограничительным ферментом ХЬа I расщепив фрагмент на два в сайте расщепления Xba I (расположенном в 5 непереводимом участке). Фрагмент

Xba I RI, несущий участок сигнального пептида, затем вставляют в сайт

32

3l

1479004

ХЬа I — Есо RI pKFN 045, получив плазмиду pKEN 054 (pIN-II, С-1).

Первая стадия конструирования А-1 выражаемой плазмиды серии pIN-III заключается в клонировании гена lac I

5 в pBR 322, Чтобы получить это, фрагмент ДНК длиной 5,1 тыс. оснований, содержащий ген lac 1, получают из плазмиды рР В140 следующим образом:

15 мкг ДНК-плазмицы pF B140 переваривают с 80 ед. ограничительного фермента Fco RI в 200 мкл буфера Есо RI при 37 С в течение 2 ч. Реакционную о смесь экстрагируют фенолом, фрагменты ДНК осаждают 2,5 объемами этанола и сушат под вакуумом. Затем ЛНК переваривают до конца с 12 ед, ограничительной эндонуклеазы Pst 1 в 300 мкл реакционной смеси, содержащей 20

6 ммоль/л трис-НС1 (рН 7, 5), 5 ммоль/л

MgCl<, 50 ммоль/л NaC1, 6 ммоль/л

Р-меркаптоэтанола и 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (эту смесь называют 6yAepoM Pst I) при 37 С в 25 течение 2 ч, Фрагмент Pst I — Есо RI длиной 5,1 тыс, оснований, несущий ген lac 1, очищают электрофорезом агарозного геля, фрагменты ДНК в агарозном геле подкрашивают бромистым 30 этидием (один микрограмм/мл, . и выреI зают полосу, соответствующую фрагменту 5 1 тыс. оснований, Фрагменты ДНК в этой полосе элюируют из геля после замораживания, Бромистый этидий удаляют из фрагментов ДНК фенольной экстракцией, и ДНК выделяют осаждением этанолом, Чтобы клонировать фрагмент Pst I

Есо RI длиной 5,1 тыс, оснований, содержащий ген lac 1 в pBR 322, сначала осуществляют делецию меньшего фрагмента ДНК, лежащую между сайтами расщепления Pse I u Fco RI pBR 322 следующим образом: 10 мкг ДНК pBR 322 45 переваривают с 2 ед, ограничительного фермента Pst I в 100 мкл буфера

Pst I при 37 С в течение 3 ч, После фенольной экстракции и этанольного осаждения ДНК сушат под вакуумом, а затем переваривают с 80 ед. ограничительно фермента Есо RI в общем объеме 200 мкл буфера Есо RI при 37 С в течение 2 ч, Большие фрагменты Pst IЕсо КТ, содержащие примерно 3 7 тыс ° 55 оснований, очищают электрофорезом на агарозном геле, Очищенные фрагменты (0,07 мкг) смешивают затем с О,! мкг предварительно полученных фрагментов рГ В!40 длиной 5,1 тыс. оснований, и цепкие концы Pst I и Есо RI легируют путем обработки 20 ед. Т4 ДНК-лигазы в

25 мкл лигазного буфера, содержащего

0,48 ммоль/л АТФ, при 12,5 С в течение 16 ч. Пятнадцать микролитров легированной смеси используют для трансформации штамма W 620, recA E. coli, NRRL В-15024. Выделяют плазмиду рЧ

М051, NRRL В-15025. Плазмиду получают из NRRL В-15025 обычными способами.

Плазмида pV М051 несет фрагмент

ДНК Pst I — - Eco RI длиной 5,1 тыс, оснований, содержащий не только ген

lac 1, но также и существенную часть гена 1ас Z, Этот фрагмент содержит три сайта расщепления Hind II. в окрестности гена 1ас 1, два из которых окружают или "берут в скобки" ген

lac 1 и один из которых попадает в сам ген lac 1. Чтобы укоротить этот фрагмент ДНК длиной 5,1 тыс, оснований и в то же время сохранить ген

lac 1 целым для последующего использования, применяют следующую методику: 5 мкг ДНК плазмиды pV М051 час тично переваривают с 0,32 ед. ограничительного фермента Hind II в

75 мкл буфера Hind III при 37 С в течение 1 ч. После экстракции фенолом и осаждения этанолом ДНК сушат под вакуумом. Этот способ дает фрагменты

ДНК различной длины, один из которых несет целый ген lac 1.

Чтобы получить вектор-носитель для переноса укороченного фрагмента

ДНК, несущего ген lac 1, конструируют плазмиду, обозначенную pV MIII.

Эту плазмиду можно получить из Е.

coli А 221/lac 1 q/pV MIII,. NRRL

В-15038, Эту плазмиду получают из

ИКК? В-15038 обычными способами.

pV МШ включает сайт расщепления

Hpa I, сравнительно близко окруженный двумя сайтами отщепления Есо RI.

Эта плазмида является приемлемым реципиентом для фрагмента гена lac 1, поскольку она является членом класса плазмид, имеющих следующие характеристики: содержит единственный сайт рестрикции ограничительного фермента (т,е. сайт, встречающийся только один раз в плазмиде), который . предпочтительно дает тупые концы, такие как Нра Т, Hind II или Pvu II> выведена из pBR 322 и единственный

1479004 резом с 5Х-ным полиакриламидным ге . лем: фрагменты ДНК в полиакриламидном геле красят бромистым этидием (один микрограмм/мл) и вырезают полосу, соответствующую фрагменту дли5 ной 789 пар оснований. Фрагменты ДНК в этой полосе элюируют из геля с помощью электрофореза, Бромистый этидий удаляют из Арагментов ДНК фенольной экстракцией, а ДНК выделяют этанольным осаждением, Очищенные Арагменты ДНК длиной

789 пар оснований (1,1 мкг) затем переваривают с 12 ед, ограничительного фермента Sp I в 75 мкл буфера

Нра I при 37 С в течение 1 ч. Провели Аенольную экстракцию, после чего

ДНК выделяют этанольным осаждением и сушат под вакуумом. Фрагменты ДНК затем обрабатывают 2000 ед нуклеазы

S I в полном объеме 150 мкл буфера

$ I при 20 С в течение 1 ч. Реакцию останавливают путем добавления

15 мкл 500 ммоль/л трис-НС1 (рН 8,0) 25 и 15 мкл 250 ммоль/л ЭДТА, после чего проводят фенольную экстракцию. Чтобы удалить фенол и ионы цинка, смесь экстрагируют эфиром и диализуют проо тив 0,01 x SSC при 4 С в течение 30

1,5 ч дважды, а затем ДНК выделяют этанольным осаждением, Десять микрограммов ДНК-плазмиды

pU M053 переваривают с 12 ед. огра- 35 ничительного фермента Нра I в 100 мкл .буфера Нра I .при 37 С в течение одного часа, Фрагмент длиной 8 тыс. оснований очищают электроАорезом с

0,7Х-ным агарозным гелем, и ДНК 40 (1,1 мкг) затем обрабатывают 0,12 ед, бычьего сывороточного альбумина в

75 мкл буАера бычьего сывороточного альбумина при .37 С в течение одного о часа, чтобы предотвратить самолеги- 45 рование тупых концов Hpa I. Аенольную экстракцию проводят три раза, чтобы полностью удалить бычий сывороточный альбумин и ДНК выделяют этанольным осаждением, затем сушат под вакуумом.

Фрагменты Нра I длиной 8 тыс. оснований (0,4 мкг), полученные из

pU M053, затем смешивают с 0,05 мкг фрагментов ДНК, полученных в результате MSp I переваривания фрагмента длиной 789 пар оснований из pV M053, и ДНК легируют 400 ед. Т4 ÄÍÊ-лигазы в лигазном буфере (полный объем .!

15 мкл), содержащем 0,8 ммоль/л о

АТФ, при 12,5 C в течение 16 ч, Десять микролитрoB легированной смеси используют для трансформации штамма

W 620 rec AE. coli, NRRL В-15024, и трансформанты помещают на поверхность Ь-чашки, содержащей 50 мкг/мл ампициллина и 40 мкг/мл Х-гла. Собирают резистентные к ампициллину трансформанты, дающие белые колонии, что указывает на реконструкцию целостного гена 1ас 1. Одну из плазмидных

ДНК, выделенных из отобранных трансформантов, обозначают pVM058, Конечная стадия конструирования первой авторегулируемой стимулируемой выражаемой плазмиды серии pIN-III заключается во вставлении гена lас 1 в pKEN 045 (pIN-II, А-1). Для осуществления этого используют следующую методику: 30 мкг ДНК плазмиды р7 М058 переваривают с 100 ед. ограничительного Аермента Есо PI в 250 мкл буфера Есо RI при 37 С в течение 1,5 ч, Фрагмент Есо RI длиной 2,4 тыс, оснований очищают электрофорезом на агарозном геле, Фрагменты ДНК (2,0 мкг) затем обрабатывают 600 ед. нуклеазы

SI в полном объеме 150 мкл буфера

SI при 20 С в течение 1 ч, Реакцию останавливают путем добавления

l5 мкл 500 ммоль/л трис-НС1 (рН 8,0) и 15 мкл 250 ммоль/л ЭДТА, после чего проводят экстракцию фенолом. Чтобы удалить фенол и ионы цинка, смесь экстрагируют эфиром и диализуют проо тив 0,01 SSC при 4 С в течение

1,5 ч дважды, а затем ДНК выделяют этанольным осаждением.

Десять микрограмм ДНК-плазмиды

pKEN 045 частично переваривают с

1 ед. ограничительного фермента

Hind II в 751 мкл буфера Hind III npu

37 С в течение 30 мин. pKEN 045 вклю-, чает два сайта отщепления Hind II, один из которых является также сайтом отщепления Sal I. Частичное переваривание с ограничительным ферментом Hind II дало смесь линейных фрагментов ДНК, самый длинный из которых был расщеплен только в одном из сайтов расщепления Н .nd TI. Эти фрагменты (каждый длиной примерно 5,0 тыс, оснований) выделяют электрофорезом на 0,77-ном агарозном геле, Линеаризованные ДНК (2,5 мкг) обрабатывают 0,15 ед, бычьего сывороточного альбумина в 50 мкл буфера бычье1479004

20 га сываратачна(o;lльбуминя нри 37 С в теченис) ч, чтобы нредс)твратить самалегиравяние тупых канцс в Hind TT

Фенальнук) экстрякнию прс водят трижды, 5 чтобы полностью удалить бь)чий сыво— ратачный яльбумин, ДНК выделяют э тянальным осаждением, а зятем высушивают пад вакуумом. (7)рягменты Есо ВТ. длиной 2,4 тыс, оснований (0,15 мкг), полученные рЧ М058, затем смеп(ивяют с 0,3 мкг фрагментов pKEN 045 длиной 5,0 тыс. оснований и обрабатывают 400 ед.

Т4 ДНК-лигязы в 15 мкл лигазнаго буфера, содержащего 0,8 ммаль/л АТ(7), при 12,5 16 ч. Десять микролитров легированной смеси используют для трансформации Е, со11 штамма W 620 recA, NRRL В-15024 и отбирают резистентные к ямпипиллину трансформанты, используя Х-гал, Появление белых колоний подтвердило вставление гена lac 1 в сайт Hind II, расположенный ниже от гена Al))p(. 25

Эта трансформация дает плазмиды, несущие ген lас 1 в двух различнь)х ориентациях. Плаэмиды с этой структурой обозначены pV М061 (pIN-TII, А-1). 30

Есть несколько методов конструирования плазмид pIN-III, соответствующих рамкам считывания А-2 и А-3

Если имеются в наличии копии плазмид

А-2 и А-3 серий pIN-I u pIN-ТТ, то способ включает вставление фрагмента гена lac 1 s плазмиды pKEN 049 (pIN-II, А-2), и pKFN 050 (pIN-II, А-3) ° В- альтернативном и предпочтительном способе просто требуется использовать меньшие фрагменты Xba I

Есо RI pKEN 049 и pKEN 050 или pKEN

039 (pIN — I, А-2) и pKFN 040 (pIN — I, А-3) вместо меньшего фрагмента ХЪа I

Есо RI pV M061 аналогична тому, чтобы получить плазмиды А-2 и А-3 серии

pIN-III, Полагая, что еще нет соответствующих структурн61х (pIN I) и стимулиру емых (pIN-II) плазмид, можно получить авторегулируемые стимулируемые плазмиды А-2 и А-3 непосредственно из плазмиды рТ >,061 (А-1) . Последовательность ДНК в окрестности сайта расщепления Есо RI pV M061 изменяют, чтобы непосредственно получить струк— туру плазмид Л-2 и А-3 саатветствен— но серии pIN-TIT.. Эта наиболее предпочтительный способ конструирования, I l l! ны;: 17!1лэ мил ) ПО скал 7>1(v для H Р Га

HР нУжno п1)РДв IT)IITPJlhHo ка!(с ТРУIIP( лять с(ответствующие нлязмид I pTN 1 !

) Т ) - T T

E(ть также нескал),Ko IIHHI(o));Hñ сте" каис труnpc) IJHHHv р TN — т Т Т нляэ мнд, содержащих встав() чнь(е с яйты В и С . 11o— лагяя, чта уже с кангтруировяны сопгветству)()1(ц7е р 111-I H pIN-ТТ плязмнДы) их маци(1)))пируют чтобы Бс тл вить фрагмент 1 PHя lас 1, чта няис(шлее предпачтительн(э, меньший фря гмент

Xba I — Eco RI pV М06! (рIN-III, А-1) последовательно заменяют меньшими фрагментами Xba I — F(o RT ат каждой из структурной или стимулируемс "I пляз— мидь) В-сайтя или С-сяйтя, чта дает в любам случае р?И-III H-ñàéòoâó) и Ссайтавую плазмиды.

Наиболее предпачтительнс, адняка, конструировать р?И-IIT выражаемые плазмиды без первоначальнага получения соответствующих плазмид pIN I или pIN-II. В случае встявачнага сяйта В-плязмиду В-1 р?И-III полу-яют 1(э плазмиды pKEN 221 путем переваривания ДНК-плазмиды pKEN 221 ограничительным ферментом Fnu Н-1 с последующим присоединением цепких концов

Eco RI к концам полученного фрагмента ° Полученный таким образом фрагмент

Eco RI затем переваривают с помощью ограничительного фермента Xba I, расщепив фрагмент на двя в сайте расщепления Xba I расположенном в 5 -непереводимом участке, Посредством очистки полученного таким образом меньшего фрагмента Xba Х вЂ” Гсо RI и использования его вместо .. pHIшега фрагмента Xba I — Есо RI р". .061 (pIN-III

А-1) получают В-1 автарегулируемый стимулируемый клонируемый вектор-носитель, Полученную плазмиду модифицируют, чтобы получить рт(1-ХТТ плазмиды, соотгетствующие рамкам считывания В-2 и В-3 соответственно.

Аналогичным образом можно непосредственно получить pIN-III плязмиды С-сайта без первоначального конструирования соответствующих плазмид

pIN-I или pIN-II, В частности, после переваривания ДНК-плазмиды pKFN III ограничительным ферментом Sau ЗА и присоединения цепк(1х канцсв Есо Р? к концам полученного фрагмента полу-— ченный таким образам фрагмент Еса RT затем переваривII()T с агряничительн1)м ферментом ХЬа I, расщепив фрагмент 1(я

1479004 40

-рансформантов IE 559 Е, coli

NRRL В- 15104 отбирают клоны, содержащие плазмиду pKFN 010, клонируют фрагмент с фосфорилированной Sal I " связкой плазмиды рКЕН IIХ длиной

I ""

0,95 кв, кодирующий 3 -непереводимый участок и сайт окончания транскрипции 1рр гена в плазмиду pKFN 014, предварительно полученную иэ плазмиды pBR 322 делецией Hind-III—

Bam HI фрагмента длиной 0,35 кв, получают рекомбинантную плазмиду pKEN

018, далее соединяют фрагмент липопротеинового промотора с фрагментом окончания транскрипции, для этого заменяют Pvul — Есо RI фрагмент размером 0,65 кв плазмиды рКЕМ О!8 на фрагмент Pvu I — Есо RI размером

1,1 кв плазмиды pKEN 010, полученную плазмиду pKEN 0,21 модифици руют, вставив Hind III сайт между существующими сайтами Есо RI u Bam

HI промотор-оператор 1ас uv 5 кло25 нируют в Xba I сайт плазмиды pKEN

037, в полученной плазмиде pKEN 038 удаляют Xba I сайт, отбирают amp + клоны, содержащие pKEN 045, после чего клонируют lac 1 ген в плаэмиду

pVM III, выделяют плазмиду pVM 052 и

pVM O53 производят делецию фрагмента гена lac Z сохраняя нетронутым ген lac I в плазмиде pVM 0,53> связывают Eco RI фрагмент размером 2,4 кв полученной плазмиды pVM 058 с

Hind III фрагментом размером 5,0 кв плазмиды pVM 045. и выделяют конечную векторную плазмиду pVM 061 из трансформированных клонов штамма бактерий

40 Е. coli NRRL В-15024, два в сайте расщепления Xba I (расI положенном в 5 -непереводимом участке), Фрагмент Xba I — Есо RI, несущий участок сигнального пептида, затем вставляют в сайт ХЬа I — Есо RI

5 плаэмиды рМ061, чтобы получить С-1 плаэмиду pIN-III. Последующей модификацией плазмидной ДНК получают pINIII плазмиды, соответствующие рам- 10 кам считывания С-2 и С-3 соответственно.

Структурный ген, кодирующий гормон человека или другой нужный полипептид, можно выразить в трансформи- 15 рованных бактериальных хозяевах, используя рекомбинантный плазмидный клонируемый вектор-носитель по предлагаемому способу и при этом получить значительные количества нужного . 20 полипептида.

Формула изобретения

Способ конструирования вектора

pV М061, заключающийся в том, что смесь Hind-III фрагментов ДНК штамма Fscherichia coli К12 клонируют в -фаг 2540, отбирают фаг Ъ lpp

Ес-1, содержащий полный липопротеиновый ген, субклонируют Hind-III фрагмент длиной 2,8 кв данного фа га с фосфорилированной Есо RI связкой в плазмиду pS С101, отбирают трансформанты, содержащие плазмиду

pKEN III, далее субклонируют Alu I фрагмент размером 0,46 кв плазмиды

pKEN в pBR 322, отбирают клоны, содержащие плазмиду pKEN 008, исключают сайт Fco RI в pKEN 008, среди

Составитель Н,Кузенкова

Редактор В.Данко Техред Л.Сегдюкова

Корректор С.Шекмар

Заказ 2378/58 Тираж 501

Подписное

BHHHIIH Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101