Способ первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои

 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано для первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои. Целью изобретения является повышение достоверности первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои. Способ заключается в инокуляции стерильных семян сои исследуемыми штаммами бактерий RHIZOBIUM, выращивании растений в стерильных для корневой системы условиях в течение 15-20 сут. до появления клубеньков, затем пересадке растений в почву с природной популяцией клубеньковых бактерий сои и выращивании в течение 30-40 сут., определении сухой массы надземной части растений и отборе эффективных штаммов по наибольшей прибавке сухой массы растений. Способ позволяет по сравнению с известными лабораторными, вегетационными и полевыми способами повысить достоверность первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий для последующей селекционной работы с ними и при этом снизить трудозатраты. 6 табл.

СОЮЗ СОЕЕТСНИХ.

ССНАИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

4242 А1

09) (И) (51) 4 С 12 N 1/20

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМ У СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕЧЕНИЯМ И (ЛНРЫТИЯМ

ПРИ fKHT СССР (21) 4205849/30-13 (22) 04.03.87 (46) 30.05.89. Бюл. В 20 (71) Всероссийский научно-исследовательский институт сои (72) В.А.Тильба, С.А.Бегун и Е.В.Садовская (53) 631;816.211:576.8 (088.8) (56) Интенсификация возделывания сои на Дальнем Востоке. Новосибирск, 1984, с. 17-26.

Сэги И. Методы почвенной микробиологии. M. Колос, 1983, с. 296. (54) СПОСОБ ПЕРВИЧНОГО ОТБОРА ЭФФЕКТИВНЫХ ШТАИМОВ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ

СОИ (») Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано для первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои. Целью изобретения является повышение достоверности первичИзобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано для первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои.

Цель изобретения — повышение достоверности первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бакте рий сои.

Способ заключается в инокуляции стерильных семян сои исследуемыми штаммами бактерий Phizobium, выращивание растений на 1 этапе в стерильных для корневой системы условиях в течение 15-20 сут до появления клубеньков на корнях растений, пере2 ного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои. Способ заключается-в инокуляции стерильных семян сои исследуемыми штаммами бактерий

Rhizobium, выращивании растений в стерильных для корневой системы условиях в течение. 15-20 сут до появления клубеньков, затем пересадке растений в почву с природной популяцией клубеньковых бактерий сои и выращивании в течение 30-40 сут, определений сухой массы надземной части растений и отборе эффективных штаммов по наибольшей прибавке сухой массы растений. Способ позволяет по сравнению с известными лабораторными, вегетационными и полевыми способами повысить достоверность первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий для последующей селекционной работы с ними и при этом снизить трудозатраты. 6 табл. садке на 2 этапе растений в почву с природной популяцией клубеньковых бактерий сои и выращивание в течение

30-40 сут, определение сухой массы надземной части растений и отборе эффективных штаммов бактерий по наибольшей прибавке сухой массы растений °

Пример. В пробирку диаметром

21 мм и высотой 200 мм помещают полоску фильтровальной бумаги (шнрина

200, высота 150 мм), сложенную гармошкой и затем свернутую в рулон.

Для поддержания влажности вокруг семян в верхней части рулона делают углубление. В пробирку.вносят 20-30 мл

1482942 питательной среды для растений следующего состава, г/л: К,НРО4 1,0;

МАМБО 1,0 СаБОд 0,5, FeSO< Н ВО, МпБО, и соль молибдена следы.

Пробирку закрывают и стерилизуют в автоклаве при 1 атм 30 мин. В подготовленную пробирку с фильтровальной бумагой высаживают по одному сте. рильному семени сои и вносят 1 мл суспензии клубеньковых бактерий сои с содержанием 1 млн. клеток/мл. В контрольные пробирки вносят 1 мл стерильной воды. Пробирки, закрытые ватными пробками, термостатируют в течение 3-5 сут при 25-27 С до прорастания семян сои. Затем их выставляют на стеллажи с дополнительным освещением. Для затенения корневой системы растений на пробирки одевают колпачки из плотной бумаги или темной пленки. В день выхода семядолей .,из пробирки ватные пробки снимают, а вокруг стебля укладывают фильтр из ваты. По мере необходимости соблюдая стерильность, в каждую пробирку дополнительно вносят по 10-20 мл питательного раствора. Растение сои в пробирках со стерильной корневой, системой выращивают в течение 1530 сут. Выявлено, что для образования клубеньков на корнях за счет искусственной инок1 ляции достаточно выращивания растений сои в пробирках в течени 15-20 сут. К .этому времени на корнях сои насчитывают в среднем

7-11 клубеньков в расчете на одно растение.. Более короткий промежуток времени выращивания растений в пробирках (менее 15 сут) не в полной мере обеспечивает образование клу- беньков на корнях сои. Достоверность данных проверяют по отсутствию клубеньков на корнях неинокулированных растений сои. На каждом варианте выращивают не менее 15 растений сои.

На втором этапе способа 15-20-суточные растения сои с клубеньками на корнях извлекают из пробирки и сразу же пересаживают в почву с природной популяцией специфичных клубеньковых бактерий. Пересаженные в почву предварительно инфицированные растения сои некоторое время устойчивы к вторичному заражению клубеньковыми бактериями, обитающими в почве. Этого времени достаточно для проявления

55 эффективности исследуемых штаммов клубеньковых бактерий сои.

После высадки растений сои в почву проводят первичный полив. В течение 30-50 сут растения сои выращивают в почве с естественными (поле) или искусственными (теплица) условиями. По приросту сухого вещества надземной массы сои определяют эффективность испытываемых штаммов клубеньковых бактерий.

i В опыте были изучены штаммы клубеньковых бактерий сои Rhizobium

japonicum-646, 648а, 639а, ТС-37, ТД-55, АС-17 (табл.1.) .

Испытание указанных штаммов сои лабораторно-полевым способом показaло их существенно разную эффективность в повышении массы сухого вещества надземной части растений. Так, штаммы 648а и 639а дают прирост сухого вещества надземной массы сои в

2, 1-2,5 раза и более эффективны в сравнении с известным штаммом 646, Определение длительности лабораторного и полевого этапа выращивания сои в способе.

При отработке способа установлено появление клубеньков на корнях сои на.первом этапе на 12-15 сут после посева инокулированных семян в пробирки.

Однако некоторые штаммы клубеньковых бактерий через указанный выше период времени вызывали образование клубеньков на корнях сои только у

78-957 .растений. При увеличении первого периода до 20 сут клубеньки на корнях сои отмечают практически у всех растений. Поэтому первый этап способа ограничивают 15-20 сут выращивания сой в стерильных пробирках.

Оптимальная продолжительность выращивания пересаженных в почву растений сои (второй этап способа) составляет 30-40 сут (табл.2). При увеличении продолжительности выра; щивания растений сои на втором этапе способа заметно снижается эффективность искусственной инокуляции. Более короткая продолжительность выращивания растений сои не обеспечивает оптимального проявления эффективности испытываемых штаммов клубеньковых бактерий.

Сравнительная оценка способов первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои.

1482942

- 10

Первичный отбор эффективных штаммов бактерий сои R.japonicum проводят известным лабораторным и лабораторно — полевыми способами.

Описание постановки опыта согласно лабораторно-полевому спосббу описано выше, при этом используют сорт сои ВНИИС-1.

Известный лабораторный способ пер вичного отбора штаммов бактерий сои, заключается в выращивании инокулированных растений в сосудах емкостью

1 л на стерильной агаризованной среде, песчаной культуре или почве.

Агаризованная среда представляет собой раствор Прянишникова с 0,1 нор мой азота и добавлением 2% агар-агара. Этот же раствор, но без агарагара используют для .песчаной. культуры. Приготовленные сосуды с субстратами стерилизуют при 2 атм в течение 30 мин. В сосудах с песком и почвой поддерживают влажность на уровне 70%. от полной влагоемкости. Семена сои инокулируют из расчета 1 млн. бактериальных клеток на 1 семя. Используют сорт сои

ВНИИС-1. В каждом сосуде оставляют. по 4 растения, которые выращивают

30-40 сут. Дальнейшее выращивание растений сои ограничивают возможностями емкости сосудов, а также высокой агрессивности природных Phizobium japonicum. Использование многолитровых сосудов резко снижает обьем испытываемых штаммов, что недопустимо при первичном отборе.

В лабораторно-полевом способе первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои также использовался сорт ВНИИС-1. Семена инокулировались из расчета 1 млн./мл клеток на одно семя.

Предлагаемый способ состоит из двух этапов — лабораторного и полевого. В условиях лаборатории бактеризованные растения сои выращивали в пробирках на фильтровальной бумаге до фазы образования клубеньков в течение 15-20 сут. За счет выращивания растений сои со стерильной корневой системой в пробирках удается резко увеличить количество испытываемых штаммов.

Сравнивая известный (лабораторный) и лабораторно-полевой способы первичного отбора (табл.3) отмечают значительные преимущества последнего.

В анализируемых способах испытывают примерно одинаковое количество штаммов клубеньковых бактерий сои с различной эффективностью. В качестве стандарта-эталона используют известный эффективньпi штамм 646.

При использовании известного лабораторного способа с тремя видами субстрата только в песчаной культуре удается отобрать минимальное количество штаммов клубеньковых бактерий сои для последующих испытаний в полевых опытах. В сосудах, где используют в качестве субстрата агар-агар и почву, искусственная инокуляция семян сои не оказывает положительноro влияния на продуктивность растений. В среднем из 45 испытываемых штаммов известным способом только 2Х повьппают продуктивность растений сои на 25% в сравнении с контролем.

В то же время при испытании этих же штаммов лабораторно-полевым способом 61Х бактериальных культур повышают продуктивность растений сои более чем на 25Х табл,3).

Способ позволяет выявить штаммы, вызывающие .повьппение продуктивности растений сои в 2-2,5 раза по сравнению с контролем. Это дает возможность вести первичный отбор наиболее эффективньп: штаммов клубеньковых бактерий сои для последующего окончательного их:испытания; в полевых опытах (табл.4) .

Такие данные приведены в табл.4 по сравнительному анализу эффективности штаммов лабораторно-полевым и. известным способом проведения первичного отбора.

Известный штамм 646 не эффективный при испытании его известным лабораторным способом с субстратами агар-агар, песок, почва. Использование нового способа эффективности этого штамма подтверждается.

Штаммы 648а, 639а, ТС-37, ТД-55, .

АС-17, испытываемые известным способом, являются слабо эффективными или не эффективными. При испытании их лабораторно-полевым способом эти штаммы показывают высокую эффективность. Так, штаммы 648а и 639а увеличивают прирост сухого вещества надземной массы сои в 2, 1-2,5 раза.

Сравнивая результаты, полученные лабораторным и лабораторно-полевым

1482942

Т а блица 1

Масса надземной части сои, % к контролю

Штаммы

646 (известный штамм)

648а

639а

ТС-37

ТД-55

АС-17

178

257

219

109

148

Т а блица 2

Продолжительность второго этапа, сут.

Количество испы Иэ них повышающие прирост надземной массы сои, Ж к общему тываемых штаммов

Всего в т.ч. с прибавкой

25 725

30-35

50

10

74

74

10

0 способами первичного отбора перспективных штаммов, установлены значительные преимущества последнего.

Способ позволяет резко поднять ре5 зультативность и достоверность первичного отбора новых штаммов клубеньковых бактерий сои, он менее трудоемок, дает возможность вести отбор

" штаммов не только в летний (поле), но и зимний (теплица) периоды, что ускоряет селекционный процесс.

В табл.5 показаны результаты вегетационного опыта по оценке эффективности штаммов риэобий сои. 15

В сравнении с лабораторно-полевым способом, в котором для этих штаммов установлены существенные различия в эффективности различных штаммов от +9 до +257Ж, в вегетационном опы- 20 те по приросту фитомассы эффективность штаммов значительно более

- близкая (от -13 до +113 разница по отношению к контролю). По признаку зерновой продуктивности изменения по 25 сравнению с контролем составляют -2 до +SX. (Трудозатраты при проведении вегетационного опыта (40 сосудов Вагнера) 30 составляют (без закладки и учета урожая) 96 человекодней, тогда как при лабораторно-полевом способе (40вариантный опыт) 24 человекодня на весь объем работ.

При выявлении эффективности штаммов ризобий в полевом опыте (10-ти вариантная схема, общая площадь делянки 50 м ) общие затраты достигают

120 человекодней при учете зерновой 40 продуктивности и 60-70 человекодней при учете показателя прироста и достоверность полученных данных по сравнению с лабораторно-полевым опытом также значительно ниже (табл,6). 45

Таким образом, лабораторно-полевой способ первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои позволяет в сравнении с известными способами повысить объективность отбора и снизить трудозатраты. формула иэ обретения

Способ первичного отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои, включающий инокуляцию стерильных семян растений исследуемыми штаммами бактерий рада Rhizobium выращивание растений в стерильных для корневой системы условиях, определение массы сухого вещества надземной части растений с последующим отбором штаммов бактерий по наибольшей прибавке сухой массы растений, отличающийся тем, что, с целью повышения достоверности способа, выращивание инокулированных рас- тений в стерильных условиях осуществляют в течение 15-20 сут, затем растения пересаживают в почву с природной популяцией клубеньковых бактерий сои и выращивают 30-40 сут.

1482942

Таблица 3

Л L

Способ

Субстрат КоличестИз них повышающие прирост надземной массы сои, % к общему во испытываемых штаммов

Всего

В том числе с прибавкой.

)25

11

9

5

7

19

Лабораторный

Агар

Песок

Почва

Всего

Почва в

Лабораторнополевой

58

63 теплице

Почва в

63

63

0

49 поле

Всего

Таблица 4

Ц L I

Известный способ (лабораторный) Штаммы

Способ лабораторнополевой

1 j

Агар

Песок Почва

646 (стандарт)

648а

639а

ТС-37

ТД-55

АС-17

105

166

f03

Таблица 3

Масса сухого вещества растений, г/сосуд

Бобы Семена

r Х к контролю

Штаммы

Всего растения

Солома

Ж к контролю

100

111

107

104

105

110

100

105

1,6 г/сосуд, 0,5 г

Контроль

ТС-31

АС-37

ТС-37

ТД-73

АС-17

АС-20

АС-26

ЗД-4

19,1

18,6

21,2

20,4

19,9

20,0

21,1

18,8

19,1

20,0

15,3

15,2

16,9

16,3 l5, 9

15,5

17,5

15 0

15,1

15,6

94

121

94

111

100

9,6

9,4

10 5

10,3

9,8 9,6

10,4

9,5

9,5

9,7

98

109

107

102

108

99

99

101

178

257

219

109

148

9,5

9,2

10,7

10,1

10,1

10,4

10,7

9,3

9,6

10,3

1482942

Таблица 6

Штаммы

Показатели

23-81 24-81 25-81 26-81 30

21-81 22-81

Контроль 629а, 20-81 стандарт

6,8

81 91 112 107

106 97

100 112

100

Редактор М.Недолуженко,в l

Заказ 2785/21 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101

Надземная сухая масса, г

1-ая фаза плодообразования, % к контролю

Урожай семян сои, ц/га

Ж к контролю

6,8 7,6 7,2 6,6 6,2 5,5 6,2 7,6 7,3

18,(13 18,13 19,01 17,13 17,79 18,15 16,6318,13 18,5517,5

100 100 165 95 99 101 103 100 103 Я7

НСР 2,33 ц/га (133) х 0,81 ц (4,57) Составитель А.Кураков

Техред M.дидык ., Корректор С.Шекмар