Способ определения повреждающего воздействия химических веществ на клетки in viтrо

 

Способ осуществляется путем инкубации лимфоцитов с исследуемым веществом и регистрацией концентрации АТФ с последующей оценкой биологической активности по сравнению с контролем. С целью повышения чувствительности способа в качестве контроля используют изменения в концентрации АТФ в присутствии разобщителя окислительного фосфорилирования в среде инкубации, так и без разобщителя. При выявлении снижения концентрации АТФ в присутствии исследуемых веществ их относят к биологически активным, которые включаются, в частности, потенциально опасные химические вещества, способные вызвать изменения в энергетике и нарушении жизнеспособности клеток. Способ пригоден для выявления повреждающего действия физических факторов. Способ осуществляется с помощью устройства,которое содержит измерительную кювету, держатель кюветы со съемной конической крышкой, обеспечивающей быстрый доступ к кювете и светоизоляцию, внутренний корпус, в котором размещены светоприемник и операционный усилитель, внешний корпус. Устройство позволяет повысить чувствительность измерения за счет большого угла светосбора на фотокатоде светоприемника, так как фотокатод максимально приближен к измерительной кювете, а между ними установлен фотозатвор, в который вмонтирован держатель кюветы. Операционный усилитель собран на одной микросхеме. В качестве регистратора использован самопишущий потенциометр.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ.

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

8" ГОМА!ЫР, H3iv1i, .

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21 ) 4 23001 О/28-14 (22) 17.04,87 (46) 30..05.89, Бюл, В 20 (71) МГУ им, N.Â.Ëîìoíîñîâà и Государственный центральный институт физической культуры. (72) В.Н.Ларионов, Е,Н,Мохова, Н.И.Приорова и А.Н.Тараканова (53) 612.015(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

11- 1090719, кл. G 01 N 33/48, 1984. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВРЕЖДА10ЩЕ(О ВОЗДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ НА

01ЕТКИ IN VITRO (57) Способ осуществляется путем инкубации лимфоцитов с исследуемым веществом и регистрацией концентрации

АТФ с последующей оценкой биологической активности по сравнению с контролем. С целью повышения чувствительности способа в качестве контроля используют изменения в концентрации

АТФ как в присутствии разобщителя окислительного фосфорилирования в среде инкубации, так и без разобщителя. При выявлении снижения концентрации АТФ в присутствии исследуемых

Изобретение относится к биологии, в частности к определению токсических веществ °

Цель изобретения — повышение чувствительности способа за счет измерения уровня АТФ в лимфоцитах, инкубированных с разобщителем окислительного фосфорилирования и без него.

На фиг.1 представлена электронная схема устройства хемпломинометра; на

ÄÄSUÄÄ 1483368 А I

Ъ (51)4 G 01 N 33/48 веществ их относят к биологически активным, которые включаются, в част ности, в потенциально опасные химические вещества, способные вызвать изменения в энергетике и нарушение жизнеспособности клеток. Способ пригоден для выявления повреждающего действия физических факторов . Способ осуществляется с помощью устройства, которое содержит измерительную кювету, держатель кюветы со съемной конической крышкой, обеспечивающей быстрый доступ к кювете и светоизоляцию, внутренний корпус, в котором размещены светоприемник и операционный усилитель, внешний корпус. Устроиство позволяет повысить чувствительность измерения за счет большого угла светосбора на фотокатоде светоприемника, так как фотокатод максимально приближен к измерительной кювете, а между ними установлен фотозатвор, в который вмонтирован держатель кюветы. Операционный усилитель собран на одной микросхеме. В качестве регистратора использован самопишущий потенциометр. фиг.2 представлена конструкция устройства хемилюминометра.

Схема состоит из фотоэлектронного умножителя ФЭУ-84-3, операционного усилителя на одной микросхеме (К544 УД 1Б) и внешних источников питания. Для питания микросхемы применяют источники питания +12 В при токе потребления 3-4 иЛ. Для питания

ФЭУ используют стабилизованный вы1483368 соковольтный источник питания на

1000-1200 В при токе потребления

0,6 мА. В качестве регистратора применяют стрелочный микроамперметр или самопишущий потенциометр.

Устройство (фиг.2) содержит измерительную кювету 1, держатель кюветы 2 со съемной конической крьппкой 3, обеспечивающей быстрый доступ к кюве- 10 те и светоизоляцию, внутренний корпус 4, в котором размещены фотоэлектронный умножитель с динодным делителем 5 и операционный усилитель 6, и внешний корпус 7. 15

Дно измерительной кюветы приближено к фотокатоду ФЗУ, что обеспечивает большой угол светосбора (около 100 ), Между дном измерительной кюветы и фотокатодом ФЭУ установлен фо- 20 тоэатвор 8, в который вмонтирован держатель кюветы. Фотозатвор необходим для защиты фотокатода ФЭУ от внешнего света при снятии крышки кюветодержателя для внесения добавок в кювету.

Пример 1. Лимфоциты вьщеляются из тимуса крысы стандартным способом. Лимфоциты (10Я кл/мл) инкубируют в ячейке из ор стекла рабо- 30 чим объемом 0,5 мл при постоянном перемешивании с помощью, запаянной в стекло магнитной мешалки при 37 в среде инкубации, которая содержит

145 MM NaCI; 5,6 мМ КС1; 2 мМ NaHgPO4,35

8 мМ MOPS (или другой нетоксичный буфер), рН 7,4; 10 мМ глюкоз (клетки вьщеляют в среде инкубации с 10 мМ пируватом).

После инкубации клетки фиксируют 40 в З -ной охлажденной хлорной кислоте, инкубируют 10 мин на холоде, доводят величину рН до 7,7 и центрифугируют для освобождения от выпавшего в осадок белка. Для снижения концентрации 45 солей среду разбавляют в 3 раза 50мМ трисацетатным буфером с 2 мМ ЕДТА рН 7,7, а затем измеряют АТФ по хемилюминесценции люцефирин-люциферазной системы в среде инкубации, содержащей 50 мМ трис-ацетат; 13 мМ МдС1, 2 мМ ЗДТА рН 7,7. Измерения проводят на хемолюминометре.

Определение АТФ проводят в следующих вариантах: I Перед инкубацией клеток. II, После инкубации клеток в течение 4 мин. III. После инкубации клеток в присутствии исследуемого веществ» в течение 4 мин, IV. После инкубации клеток в течение 2 мин добавляют разобщитель окислительного фосфорилирования и продолжают инкубацию еще 2 мин. Эту пробу повторяют, ступенчато увеличивая концентрацию раэобщителя до тех пор, пока не начнется отчетливое снижение концентрации АТФ. Подобранную таким образом концентрацию раэобщи-. теля используют при измерении по и. V а соответствующую концентрацию

АТФ вЂ” при расчетах.

V. После инкубации клеток в течение 2 мин с исследуемым веществом добавляют разобщитель (в концентрации, подобранной как описано в п. IV) и продолжают инкубацию еще 2 мин.

Вещества относят к биологически активным (которые вклочают и потенциально опасные вещества), если концентрация АТФ в пробе III ниже, чем в пробе II и/или в пробе V ниже, чем в пробе IV. Этн вещества отбираются для дальнейших исследований и .детальных испытаний их биологической активности. Измерения проводят на.клетках, для которых концентрация АТФ в пробе

II не ниже, чем в пробе I.

Измеряемые таким способом изменения в концентрации АТФ являются интегральными характеристиками клеток, величина. которых отражает подавление энергетики и/или жизнеспособности . клеток. Увеличение чувствительности метода достигается за счет того, что при изучении действия исследуемых веществ метаболизм клеток соответствует как состоянию покоя, так и активному состоянию (при стимуляции дыхания и АТФ-аэных активностей после добавления раэобщителя).

Пример 2. На фиг.1 показан пример выбора концентрации раэобщителя окислительного фосфорилирования

2,4-динитрофенола (ДНФ), при которой начинается снижение концентрации

АТФ. Концентрация АТФ начинает уменьшаться при 20-40 мкМ ДНФ. Эту концентрацию ДНФ и испольэовали в дальнейших опытах по изучению влияния исследуемых веществ на содержание АТФ. Примеры результатов этих опытов приведены

HHKe

Пример 3. Ингибитор клеточного дыхания ротенон в концентрации

5 нМ слабо снижает содержание АТФ в суспензии лимфоцитов, однако при ин5 1483368 кубации клеток в присутствии 20 мкМ

ДНФ 5 нМ ротенон уменьшает содержание

АТФ приблизительно в 1,5 раза, т.е, оказывает отчетливое повреждающее,.

5 действие на энергетику клеток (таблица).

Таким образом, этот пример показывает, что предлагаемый способ выявляет и вещества, снижающие жизнеспособность лимфоцитов, и по этому признаку менадион относится к потенциально опасным химическим веществам.

Пример

Проба

Концентрация АТФ, 6 пмоль/1 0 лимфоцитов

Исследуемое ДНФ, вещество мкМ

3 1 5 нМ ротенона

0 253

0 270

20 130

20 85

5 нМ роте5 нона

4 1

40 мкМ ме2 надиона

40 мкМ ме5 надиона

270

0 208

20 195

20 145

Приведенные примеры демонстрируют, что предлагаемый способ позволяет обнаружить как нарушения в клеточной энергетике, так и в целостности клеточной мембраны (снижение жизнеспособности).

Формула и з о б р е т ения е

II р и м е р 4. Менадион в кон- Способ определения повреждающего центрации 40 мкМ снижает АТФ почти в 10 воздействия химических веществ на равной степени как при инкубации лим- клетки in vitro путем инкубации хифоцитов в ДНФ, так и в опытах без мического вещества с тест-объектом разобщителя (таблица). определения изменения концентрации

АТФ по сравнению с контролем с поИзменение флуоресценции зонда (ро- 15 следующим выявлением повреждающих дамин 123) в лимфоцитах показывает, . воздействий, отличающийся что уменьшение концентрации АТФ вы- тем, что, с целью повышения чувствизвано нарушением целостности цито- тельности способа, в качестве тестплазматичеСкой мембраны. объекта используют лимфоциты тимуса, 20 определяют изменение концентрации

АТФ в лимфоцитах, инкубированных с разобщителем окислительного фосфорилирования и без него, а о наличии повреждающего воздействия судят по снижению концентрации АТФ под действием химического вещества по сравнению с контрольной пробой.

Рлияние исследуемых веществ на концентрацию АТФ в суспензии лимфоцитов

1483368

2N0np пист

Роа f .tv

Составитель Л,Сабурова

Редактор Н.Горват Техред М,Дидык Корректор А; Обручар

Заказ 2822 /42 Тираж 789 Подписно е

ВИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101