Способ оценки морозоустойчивости сортов озимой пшеницы

 

Изобретение касается физиологии растений и может быть использовано при лабораторной диагностике на зимостойкость больших наборов сортов и гибридов озимой пшеницы для целей селекции. Цель изобретения - снижение трудоемкости, повышение массовости анализов и ускорение процесса оценки. Семена исследуемых сортов и сортов с известной морозоустойчивостью проращивают при 28°С в течение 3 сут. Из проростков методом двумерного иммуноэлектрофореза выявляют белки против антител на белки морозоустойчивой пшеницы. По высоте пиков белков с подвижностью RF 0,24 и 0,30 оценивают степень морозоустойчивости, при этом чем более морозоустойчивый сорт, тем выше содержание белка с RF 0,30 и ниже содержание белка с RF 0,24.

(19) (111 (б11 4 А 01 Н 1/04, А 01 .; 7/ОО

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ бй.""

1(л,.я

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ зом.

p° ,э.=+ %», 0 .» .= СОЦИАЛИСТИЧЕС(1ИХ (Я . -=(РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4274345/31 — 13 (22) 01.07.87 (46), 23.07.89. Бюл. 1(9 27 (71) Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО АН СССР (72) С.И.Мишарин, А.И.Антипина и В.К.Войникон (53) 632.111.5(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

1(835382, кл . A 01 Н 1/04, 1979. (54) СПОСОБ ОЦЕНКИ МОРОЗОУСТОЙЧИВОСТИ СОРТОВ ОЗИМОЙ ПШ1 .НИЦЫ (57) ?1зобретение касается физиологии растений и может быть использовано при лабораторной диагностике на зимостойкость больших наборов сортов

Изобретение относится к области физиологии растений и может быть использовано при лабораторной диагностике на зимостойкость больших наборов сортов и гибридов озимой пшеницы для целей селекции.

Цель изобретения — снижение трудоемкости, повышение массовости анализов и ускорение процесса оценки.

Способ основан на том, что используют белки-маркеры, по количественному содержанию которых, можно судить о степени морозоустойчивости рвань(х сортов пшеницы. В качестве таких маркеров используют Лва белка антиген» с электрофоретической подвижностью 0,24 и 0,30, полученных лвумгрн((м пммуноэлектрофоре2 и гибридов озимой пшеницы для целей селекции. Цель изобретения снижение трудоемкости, поньппение массовости анализов и ускорение процесса оценки. Семена исследуемых сортов и сортов с известной морозоустойо чивостью прорап(ивают при 28 С в течение 3-х суток. Иэ проростков методом двумерного иммуноэлектрофореза выявляют белки прстин антител на белки морозоустойчивой пшеницы. По высоте пиков белков с подвижностью

Rf 0,24 и 0,30 оценивают степень морозоустойчиности, при этом чем более морозоустойчивый сорт, тем выше содержание белка с Rf 0,30 и ниже содержание белка с Rf 0,24 .

Разница в размерах и интенсивноности дуг преципитации одинаковых по подвижности антигенов в препаратах контрольных и охлажденных растений обусловлена изменениями в количестве отдельных белковых. компонентон. В частности, если у неохлажденных растений явно выражено количественное преобладание антигена с подвижностью Rf 0,24 над антигеном с

Rf 0,30, то у охлажденных растений наоборот преобладает пик антигена

Rf 0,30. Это обуславливается уменьшением высоты дуги Rf. 0,24 и увеличением антигена Rf 0,30. Причем, даже неохлажденные 3-дневные проростки озимой пшеницы морозоустойчивых сортов содержат больше антигена Rf 0,30. Чем более морозоустойчивый сорт, тем выше содержание бел1494884 кл с,1f О, ЗО и н««же с<«герж<«ние белка

Rf 0,2 . и нл<«б<«р<«т, В кл I<;"rI«c оценки f åpLò

3а 100" ; усто I«HI«<3< ziI Ii<:iioJls y«

CI1o :< б псущс сть«11«ется следующим обрл 3пм.

Для пр< ведсн»я двумерного (1«ерекрестн< го) ил«муноэлектрофоре «л 4 г э T»oJIIIðонлнш lх прoростKов, вырлшен- 15 о ных в теч<11»е 3 сут. при 28 С растирают в х<:«оггнпй комнлте в 10 ь<ч блрбитлл-:«цет «тггого буфера с рН 8,6,, содержлщего 0,01 М меркаптоэтанола, Гомогенлт «гентрифугируют при 20000 g 20 в течение 15 мин. Для электрофорезл

HcII<3JlI.l3óæò бес клеточный экстракт, вьгрлг«пенны«1 по белку, который наносят в лунки нл залитой на предметн .е стекло лглро<3ы. В качестве свидетеля ис«гель.«уют бромфеноловый синий.

Электрофпрез пр<«г«одят при силе тока 100 †1 1<Л и напряжении 80 В в течение 1,5-2 ч, пс мере выхода свидетеля н:1 1«р<«тивоппложный край стек- 30 ла. П«:«е <«;«номерного электрофорезл две и «:«ос к» с рлзд<«ленными белкпг«ьми обрл з«Г 11111 lio ге«11,««««т на стеклянную 1175ст»нку рл «и ром 4, 5х12 см и оставшуюся «;1< тг 11.1;гстинк» злл»влют 12 мл рлствор;1;«1 лрозы, :пдержлщей лнтитепл (!О мл 17-ной лглрозы н блрбиталлцет «тном буфере с рН 8,6 + 2 мл буфер «, с держл шег о 3 50 мг пиофи гьно вы-сушеHHol г:«пбу:I»HA). Перекрестный 40 иммуноэ. гектрофорез вегГут при силе тока 40 мЛ и нлпряже}IHH 40 В в течен»е 24 1. Пос.ie оког«чания иммуноэлектрофпре «л г«рг плрат отмывАют от неггрорелгирс г«лг««них белков сменой 45 физ»олог»нес кого рлствора, высушивав

«<«т <«I

iI»I<«I«f«< Iê<«I«c подвижностью Rf 0,24 и О, 30 и оден»ваю«г степень морозо— устойч»вост».

11олучен»е нысушенног0 глобул»нл осуществляют <.Jie«iy« «Iy>w путем.

И< пользуют этиолированные проростки 1«шеницы. Гастительный матер»лл I«I «p

S5 влльной буллге в lермостлте при

28 С в те 1«и» 3 сут. Температурную

;«бр<«ботку I11 < н<«дя l в течение 1 ч

< при ч l, . 11«бе l Il I 1 «lit . к ицьl H зме 1ьч<1

1<«т в ступке с жидким азот<««, л белки экстрлг»руют одним объемом 0,15М

ИЗС1 в фосфатном буфере 0,1 M (рН

7, «), содержащего 0,01 M меркаптоэтлнолл. Структурные элементы кле3ок осаждают центрифугированием при

20000 g в течение 15 мин. Высокомолекулярные соединения из супернатлнтл, используемые в дальнейшей работе, отделяют от низкомолекулярных веществ на колонке с сефадексом

Г-25 и лиофильно высушивают. Белковые препараты, полученные из охлажденных растений, используют для получения антисывороток. С этой целью лнтигены смешивают с дополнителем

Фрейнда и подкожно вводят кроликам.

В первом цикле (в три приема с недельными интерва,лами) вводят пример— но пп 75 мг белка, а при реиммунизации через месяц — по 40 мг белка.

Через 10 дн. после реиммунизации берут кровь из краевой ушной вены, oòäåëÿi<«ò сыворотку, высаливают гамма-глобулиновую фракцию сульфатом аммония (507 насыщения), диализуют против дистиллированной воды и лиофильно сушат.

Ф о р м у л а и э о б р е т е н и я

Способ оценки морозоустойчивости сортов озимой пшеницы, включающий предварительное проращивание в лабораторных условиях семян исследуемых сортов и сортов с известной морозоустойчивостью до стадии проростков и измерение у них биохимических показатепей, по значению которых у исследуемых сортов при сравнении их с показателями образцов с известной морозоустоичивостью оценивают последнюю, отличающийся тем, что, с целью снижения трудоемкости, повышения массовости анализов и ускорения процесса оценки, измерение осуществляют на 3-суточных проростках, а качестве биохимического показателя используют белки, выявленные двумерным иммуноэлектрофорезом против антител на белки морозоустойчивой пшеницы и по высоте пиков белков с подвижностью Rf

0,24 и 0,30 оценивают степень морозоустойчивости, при этом чем более морозоустойчивый сорт, тем выше содержание белка с Rf 0,30 и ниже содержание белка с Rf 0,24.