Способ получения изомальтулозы

 

Изобретение относится к биотехнологии, касается непрерывного преобразования сахарозы в изомальтулозы и может найти применение в пищевой промышленности в качестве сахарозаменителя. Цель изобретения - повышение выхода и чистоты целевого продукта. Способ предусматривает ферментативную изомеризацию 45-75% раствора сахарозы путем пропускания его через реактор с иммобилизованными клетками PROTAMINOBACTER RUBRUM CBS 57477 или SERCATIA PLYMUTHICA ATCC 15928 или S.MARCESCENS NCIB 8285 при температуре от 40 до 65°С. Для иммобилизации клеток в основном пригодны все методы приведения в неподвижность клеток. Благодаря двухступенчатой кристаллизации получают в кристаллической форме до 91,5%, имеющейся в растворе изомальтулозы. 7 з.п. ф-лы.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) еейа ц

ЫИ! т;:"

Е..R

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К flATEHTV

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР

1 (21) 3335150/28-13 (22) 10.09.81 (31) Р 3038219.5 (32) 09,10.80 (33) DE (46) 30.09.89. Ьюл. )) 36 (71) Зюддойче Цукер-Акциенгезельшафт (РЕ) (72) Мохаммад Мунир (РК) (53) 577. 15 (088.8) (56) Патент ФРГ К" 2217628, кл. С 12 Р 19/12, опублик. 1972, Выложенная заявка ФРГ )) 2806216, кл. С 12 P 19/12, опублик, 1980.

Патент СССР ) 1022663, кл. С 12 Р 19/12, 1978. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗОМАЛЬТУЛОЗЬ! (57) Изобретение относится к биотехнологии, касается непрерывного преобИзобретение относится к биотехнологии и касается непрерывного преобразования сахарозы в изомальтулоэу (палатинозу, 6-,0-<-D-глюкопираноэид D-фруктозу) при помощи неподвижных клеток бактерий, Изомальтулоза является промежуточным продуктом для получения глюкопи1 ранозид-1,6-манита и глюкопиранозид1,6-сорбита (изомальтита), которые являются заменителями сахара.

Цель изобретения - повышение выхода и чистоты целевого продукта.

Для реализации способа с целью получения иммобилизованных клеток осуществляют оптимальное размножение клеток в питательной среде, содержащей только 5 мас./ сухих веществ, (S1) 4 С 12 P 19/12 // (С 12 Р 19/12, С 12 R 1:425, 1:01) разования сахарозы в изомальтулозу и нажет найти применение в пищевой промышленности в качестве сахарозаменителя. Цель изобретения - повышение выхода и чистоты целевого продукта.

Способ предусматривает ферментативную изомериэацию 45-754-ного раствора сахарозы путем пропускания его через реактор с иммобилизованными клетками

Proiamino bacter ruhrum CBS 57477 или

Serratia p1ymuthica ATCC 15928 или

S. marcescens NCIB 8285 при 40-65 .С.

Для иммобилизации клеток в основном пригодны все методы приведения в неподвижность клеток. Благодаря двухступенчатой кристаллизации получают д в кристаллической форме до 91,5(, имеющейся в растворе изомальтулазы.

7 з.п. Ф-лы.

С:

Питательная среда содержит густой сироп (промежуточный продукт сахарной промышленности, маисовую воду для набухания и (NH ) НРО4. Однако предпочтительным является использование более дешевого питательного субстрата, который состоит только из мелассы кормовой свеклы и (ИН ) НРО ;

Для приготовления такого питательного раствора мелассу разбавляют дистиллированной водой ро 54-ного содержания сухого вещества, В качестве дополнительного источника азота и фосфата на 100 кг такого раствора до бавляют 0,1 кг (НН )) НРО . Значение рН устанавливают равным 7,2 при помощи натрового щелока, раствора едкого калия или соляной кислоты, 3 151248

Вакцинация микроорганизма, например Protaminobacter rubrum CBS 574.77, образующего иэомальтулоэу, происходит при промывке 10 мл стерильного питательного раствора указанного состава, а ферментацию осуществляют в кацалоцных колбах, заполненных 200 мл этой питательной среды, при 29 С. Когда количество микроорганизмов в загруженной культуре достигает 5х10 ми кроорганизмов/мл, культуру переносят в небольшой ферментер с питательной средой указанного состава и далее культивируют при возможно более высо- 15 кой степени аэрирования и скорости о перемешивания при 29 С, Контроль за размножением осуществляют так же, как и контроль за размножением в кацалоцных колбах, путем определения числа микроорганизмов, Как только количество микроорганизмов достигнет значения 5х10 микроорганизмов/мл, ферментер освобождают.

Для получения иммобилизованных клеток s основном пригодны все методы иммобилизации клеток Х.С1ПВАТА (Immobilized Enzymes, John Wiley and

sons, New Jork, 1.ondon, 1978), В качестве предпочтительных признаны следующие методы, а) Содержимое для Ферментации добавляют либо в сам ферментер, либо в другой сосуд с 1/-ным раствооом катионоактивного коагулянта. Тре6уемое количество коагулянта должно оыть

35 определено в предварительном опыте, Клеточную массу, подвергнутую коагуляции, отстаивают, освобождают от лишней воды и далее осадок дважды промывают фосфатным буфером 0,1 М, рН 7.0 . После этого клеточную массу обезвоживают до получения пастообразного вида, прессуют в полости, сушат, размалывают и просеивают.

b) К 10 л ферментативного бульона при медленном помешивании добавляют

0,5-2,л 0,24-ного раствора хитозана, (коагулированную клетоцную массу промывают фосфатным буфером О,1 М, рН 7,0, обезвоживают в центрифуге. например с химическим принципом действия или в отстойной, прессуют в полосы, сушат, размалывают и просеи, вают, с) В центрифуге клеточную массу отделяют от ферментационного бульона.

5-20 r этой клеточной суспензии (содержание сухого вещества 104) суспен9 4 дирую в 45-60 мл раствора альгината (8 r в 100 мл) и при помощи шприца (диаметр иглы 0,55 мм) каплями вводят в 23-ный раствор СаС1,, Появляющиеся гранулы примерно 15 мин перемешивают в растворе СаС1 и после этого промывают водой, Приблизительно в течение

20 ц гранулы сушат при комнатной температуре, d) В центрифуге клеточную массу отделяют от ферментационного бульона, промывают фосфатным буфером (0,1 М, рН 7,0) и подвергают сублимационной сушке,.

При 90 С под флегмой 15 г ацетата целлюлозы растворяют в 100 мл смеси диметилсульфоксида и ацетона (6:4).

После охлаждения ро 30 С добавляют

3-30 r сублимированных клеток. Эта суспензию при помощи иньекционного шприца (игла 0,8 мм) в виде капель вводят в воду, Образующиеся гранулы высушивают. е) В центрифуге клеточную массу отделяют от ферментационного бульона.

5 r такой клеточной массы суспендируют в 5 мл физиологического раствора поваренной соли при 45-50 С, 1,7 r

К-каррагинана (растворимый полисахаридный эфир серной кислоты) растворяют в 34 мл Физиологического раствора поваренной соли при 45-60 C. Оба раствора смешивают и в течение 30 мин о эту .смесь выдерживают при 10 С, Появляющийся гель фиксируют в холодном

0,3 M растворе КС1 и потом раскалывают на куски велициной примерно 3 мм °

f) ферментационный бульон смешивают снацала с 13-ным раствором катионоактивного коагулянта, а потом с 14ным раствором анионоактивного коагулянта либо в самом ферментере, либо в другом сосуде. Требуемое количество коагулянтов должно быть определено в предварительном опыте. Скоагулированную клетоцную массу отстаивают, промывают фосфатным буфером 0,1 М, рН 7,0, прессуют в полоски, сушат, размалывают и просеивают.

Клетки микроорганизмов, полуценные по описанным методам, подвергают иммобилизации сшивкой. 1ля сшивки применяют бифункциональные препараты, например глутаровый альдегид. Обычная концентрация глутарового альдегида, 2,5-5,04 при длительности контакта

30-45 мин в слуцае использования микроорганизмов, образующих изо20

30

35 полученного препарата в течение

10 мин перемешивают в 0,13-ном раст" воре глутарового альдегира, промывают фосфатным буфером (0,1 И, рН 7,0) и

40 освобождают от надосадочной жидкости путем декантации, Определение ферментативной активности иммобилизованных клеток дает удельную активность

60 ед/г сухого вешвства. В термоста45 тируемую колонну вводят столько иммобилизованных клеток, чтобы объем слоя клеточной массы, составлял 160 смз.

Это количество соответствует 60. г су- хого вещества. Колонну затем, нагрева50 ют до 50 С и через нее непрерывно про" пускают 703 -ный раствор сахарозы со скоростью протекания 20 смз/ч. Выходя" щий из колонны поток продукта имеет следующий состав, г/100 г сухого ве55 щества:

Глюкоза 1

Фруктоза 4

Сахароза, 0

5 151 мальтулозу, может не соблюдаться, Было обнаружено, kTO все неподвиж- ные препараты при этих условиях полностью иммобилизованы, В качестве оптимальных условий для образования поперечных связей согласно предлагаемому спосоЬу концентрацию глутарового альдегида принимают равной 0,13 при длительности обработки 10 мин.

Неподвижные клетки с поперечными связями, полученные по указанным способам, подают в колонну реактора, В этом реакторе поддерживают равномерную температуру, а отношение диаметра и высоты составляет 1: 1 - 1:20, преимущественно 1:1 -. t: 10, предпочтительно 1:1,5-1:5, Чистый раствор сахарозы (концентрация 45-753) при

40-65 С нагревают через колонну либо сверху вниз, лиЬо снизу вверх. При этом скорость потока устанавливают такой, цтобы время контакта составило ! - 10 ч, преимущественно 4-7 ч (это соответствует 0,2-0,8 г сахарозы, преимущественно 0,4-0,6 г, на 1 г неподвижных (сухих) клеток в 1 ц), При этом преобразуется полностью вся введенная сахароза, причем получают

13 глюкозы, 4Ф фруктозы, 823 изомальтулозы и 134 l-0-0-D-глюкопиранозидD-фруктозы.

Путем простого охлаждения раствора изомальтулозу частично кристаллизуют.

При выпаривании и охлаждении из ма точного раствора выкристаллизовывается дополнительное количество изомальтулозы, таким образом, в целом из полученной изомальтулозы может откристаллизовываться 91,54, В предпочтительном варианте исполнения способа раствор сахарозы пропускают через колонну более быстро для того, чтобы преобразовалось толь- .ко 75-8090 сахарозы, Часть изомальту-< лозы может быть получена в кристаллической.форме путем охлаждения потока продуктов, а остаток после добавления свежего раствора сахарозы еще раз пропускают через колонну. Преимущество .такого варианта проведения процесса состоит в том, что образование

1-0-Ы-D-глюкопиранозид-D-фруктозы подавляется благодаря более короткому. времени контактирования и в итоге может быть достигнут больший выход изомальтулозы.

Пример 1. От заражения штамма Protaminobacter rubrum CBS 574,77

2489

6 клетки промывают 10 мл питательного стерильного субстрата, состоящего из8 кг сахарного сиропа, густого, концентрации 653, 2 кг маисовой воды для набухания, 0,1 кг (ХН ) НРО и

89,9 кг дистиллированной воды (при необходимости значение рН устанавливают равным 7,2). Эта суспензия слу1О жит в качестве затравочного вещества для предкультуры в колбе объемом 1, л: с 200 мл питательного раствора указанного состава, находящейся во встряхивающем механизме, После 30-часового инкубирования при 29 С 16 л питательного раствора указанного состава, разливают по 20 колбам (4 л), рассеивают в небольшом

30-литровом ферментере и Ферментируют при 29 С при аэрации 20 л в 1 мин и скорости перемешивания 350 об/мин.

Увеличивающееся количество клеток определяют микроскопическим методом.

После того, как число клеток достигнет 5xlO клеток/мл, содержимое фер9 ментера переводят в другой сосуд, в котором его смешивают с катионоактивным коагулянтом (например, РКТМАР1ОС C/V фирмы Rohfn P Наав, Филадельфия, США), Скоагулированные клетки отстаивают, округляют, промывают Фосфатным буфером (0,1 М, рН

7,0) и обезвоживают на центрифуге.

Далее массу экструдируют в полоски, сушат на воздухе и размалывают.

Просеянную фракцию 0,3-0,8 мм из

1512489

Иэомальтулоза

1-0-g-D-глюкопираноизид-D-фруктоза 13

Полученный раствор изомальтулозы подают в кристаллизатор для охлаждения

5 о до 20 C и выкристаллизовавшуюся изомальтулозу отделяют от маточного раствора путем центрифугирования на решетчатом барабане. Маточный раствор при

70О С выпаривают до содер>кания сухого вещества 80 и снова охлаждают до

20 С в кристаллизаторе для охлажде, ния. Выкристаллизовавшуюся изомальтулозу отделяют от второго маточного 15 раствора (мелассы) на центрифуге с решетчатым барабаном. Влагодаря этой двухстадийной кристаллизации получают

91,54 кристаллической имеющейся в растворе изомальтулоэы, 20

В 100 кг выходящего из реактора раствора изомальтулозы содержится

30 кг воды и 70 кг сухого вещества, из которых 57,4 кг (82ь) составляют изомальтулозу. На первой стадии крис- 25 таллизации отделяют 32,4 кг изомаль-. тулозы и примерно 1 кг промывочной воды добавляют при центрифугировании, Получают 68,6 кг маточного раствора с 37,6 кг сухого вещества и 31 кг во- g0 ды. Чтобы этот MBTG -ный раствор концентрировать от содержания 54,83 сухого вещества до содержания 803 сухого вещества до второй стадии кристаллизации, нужно испарить 21,6 кг воды, причем количество снижается на 47,0 кг,, 35

На второй стадии кристаллизации получают 20,1 кг изомальтулозьг, таким образом, общий выход составляет

52,5 кг или 91,5 находящейся в эфлю40 ате из реактора изомальтулозы (соответствует 75/ используемой сахарозы).

Изомальтулоза с первой стадии кристаллизации имеет чистоту более 99,5% и может непосредственно использовать- „ ся далее, Изомальтулоза с второй степени кристаллизации (20,1 кг) имеет чистоту более 96,0 и ее нужно перекристаллизовывать, Для этого ее сначала растворяют в 13,4 кг воды и затем путем испарения и охлаждения вык- 50 ристаллизовывают, Испаряющееся количество воды сос> тавляет 21,6+13,4=35 кг для получения

52,5 кг изомальтулозы или 0,67 кг/кг изомальтулозы, 55

Пример 2. а) От заражения штамма Protaminobacter гиЬхит СВБ

574,77 клетки промывают 10, мл сприльного питательного раствора, состоящего из 6,25 кг свекольной мелассы концентрации 803, 0,1 кг (»1Н З НР04, и 93,65 кг дистиллированной воды (при необходимости значение рН устанавливают равным 7,2 при помощи НС1). Эта суспензия служит в качестве затравочного вещества для предкультуры в колбе объемом 1 л с 200 мл питательного раствора укаэанного состава, находящейся во встряхивающем механизме, После 30-цасового инкубирования при о

29 С 16 л питательного раствора указанного состава, разлитого по 20 колбам (4 л), его рассеивают в 30-литро-! вом ферментере и подвергают ферментации при 29 С при аэрации 20 л/мин и скорости перемешивания 350 об/мин.

Далее процесс проводят аналогично примеру 1.

Пример 3. Из субкультуры штамма Protaminobacter rubrum СВБ

574.77 клетки смывают 10 мл стерильной смеси 1 ч. сиропа концентрации

653 и 2 ч. водопроводной воды, содер>нащей 0,5 г/л (МН4) НРО . Эта суспензия служит в качестве прививочного материала для предкультуры в колбах емкостью 1 л с 200 мл питательного раствора указанного состава, стерилизованного 20 мин при 121"С, находящихся в вибрационных машинах. После культивирования в течение 30 ч при а

30 C предварительное культивирование заканчивают. 16 л питательного раствора указанного состава, разлитого по 20 колбам (общий объем 4 л), рассеивают в ферментере емкостью 30 л. ферментируют при 30 С с аэрацией 12 л/мин и при скорости перемешивания 350 об/

/мин, Выращенные в ферментере 20 л питательного раствора служат в качестве прививочного материала для ферментера емкостью 300 л со 180 л питательного раствора (смесь сиропа с сахарозой и водой с содержанием сухого вещества 25 ь, чистотой 964 в расчете на сухое вещество), ферментер работает со скоростью аэрации 200 л воздуха/мин при 30 С и скорости вращения 200 об/

/мин, После .7-часовой фазы роста добавляют непрерывно со скоростью разбавления 0,2 ч питательный раствор и рав>лое количество превращенного пита тельного раствора с клетками непрерывно .удаляют из ферментера. l 512489

500 л этого превращенного раствора содержат 2 л клеток (влажные), которые отделяют путем центрифугирования .

Концентрация остающегося раствора составляет 23,83 по сравнению с 254 в исходном растворе (потери за счет выдувания части сухого вещества). Количество раствора составляет 498х1, lOOl=

=547,8 кг с содержанием сухого вещества 130,4 кг со 101,7 кг изомальтулозы. После выпаривания до содержания сухого вещества 804 при 70 С раствор охлаждают до 20 C в кристаллиэаторе для охлаждения. Выкристаллизовывающую-15 ся при этом иэомальтулозу отделяют центрифугированием от маточного раствора.

Выход. 55,9 кг изомальтулозы с чистотой примерно 99,03.

Испарение воды на второй стадии кристаллизации 20,4 кг. Всю изомальтулозу (88,3 кг) перекристаллизовывают, чтобы повысить чистоту до величины свыше 99,53. Для этой цели ее раство- 25 ,.ряют. в 58,9 кг воды. При Кристаллизации затем эту воду нужно снова выпарить.

Выход: 85,5 кг изомальтулозы с чистотой более 99,53.

Испаряемое количество воды: 385+ .

+20,4+58,9=464,3 кг=5,43 кг на 1 кг иэомальтулозы. !

В 500 л исходного раствора содержится 138,2 кг сухого вещества (соответствует 132,7 кг сахарозы), Таким образом, выход изомальтулозы состав-, 35 ляет 64,43 используемой сахарозы, Пример 4. Фракцию просева

0,3 - 0,8 мм из полученного по примеру 1 препарата размешивают в 0,1340 ном растворе глутарового альдегида в течение 10 мин, промывают фосфатным буфером 0,1 М, рН 7,0, и путем декантации освобождают от жидкости, Определение ферментативной активности обработанных иммобилизованных клеток

45 показывает удельную активность

60 ед/г сухого вещества. Термостатируемую колонну заполняют иммобилизованными клетками, так,чтобы объем клеточной массы составил 16 л, Это 50 количество соответствует 6 кг сухого вещества, Затем колонну нагревают до 50 С и через нее непрерывно пропускают 501-ный раствор сахарозы с нормой расхода 10 л/ч. Выходящий из 55 колонны продукт имеет следующий состав, г/100 г сухого вещества:

Глюкоза 1,4

Фруктоза 4,5

Сахароза 0

Изомальтулоэа 81,1

1-0-к-D"rлюко" пиранозид-Dфруктоза 13 0

Полученный раствор изомальтулозы при 70 С упаривают до концентрации

804, подводят в охлаждающий кристаллизатор, охлаждают до 20 С и выкрис- таллизовывают изомальтулозу на фильтрующей корзиночной центрифуге и отделяют от маточника. Маточник при 70 С упаривают до концентрации 803 и в охлажденном кристаллизаторе вновь о охлаждают до 20 С. Выкристаллизовавшуюся изомальтулозу на аналогичной центрифуге отделяют от вторичного маточника (мелассы).

В 100 кг выходящего из реактора раствора изомальтулозы copepRHTcR

50 кг, сухого вещества, из которых

4g,55 кг (81,14) составляют изомальтулозу. Упаривают 37,5 кг воды, чтобы повысить концентрацию до 803.На 1-й ступени кристаллизации осаждается

22,9 кг изомальтулозы и примерно

0,5 кг промывной воды добавляют при центрифугировании, Получают в результате 40,1 кг маточника с 27,1 кг сухого вещества и 13 кг воры. Чтобы перед 2-й кристаллизацией повысить концентрацию маточника от 67,6 до 803, нужно испарить 6,2 кг воды.

На 2-й ступени кристаллизации получают 14 кг изомальтулозы, так что общий выход составляет 36,9 кг или

913 находящейся в реакторе изомальтулозы (соответствует 73,8ь использованой сахарозы). Изомальтулоза с 1-й ступени кристаллизации имеет чистоту более 99,53, и ее можно непосредст" венно применять дальше. Изомальтулоза с 2-й ступени кристаллизации (l4 кг) имеет чистоту более 96 ь, и ее еще требуется перекристаллизовать. Для этого ее сначала растворяют в 9,5 кг воды и затем путем упаривания и охлаждения выкристаллизовывают, Соответственно этому подлежащее упариванию количество воды составляет

37;5+6,2+9,5=53,2 кг для получения

36,9 кг изомальтулозы или 1,44 кг/кг изомальтулоэы.

Пример 5. Фракцию просева

0,3-0,8 мм из полученного по примеру препарата перемешивают в 0,13-ном растворе глутарового альдегида в те20

11 15124 чение 10 мин, промывают фосфатным буфером 1,0 М, рН 7,0, и путем декантации освобождают от воды, Определение ферментативной активности у обрабо-, танных иммобилизованных клеток пока5 эывает удельную активность 60 ед/r сухого вещества. Термостатируемую колонну заполняют иммобилизованными клетками, так цтобы объем клетоцной массы составлял 16 л. Это количество соответствует 6 кг сухого вещества. о

Затем колонну нагревают до 40 С и через нее непрерывно пропускают 50 -ный раствор сахарозы с нормой расхода

10 л/ч, Выходящий из колонны продукт имеет следующий состав, г/100 г cyxot-o вещества:

Глюкоза 2,5

Фруктоза 4,5

Сахароза

Изомальтулоза 82,5

1-0-Ы-D-глюкопиранозид-D-фруктоза 9,9

Полученный раствор изомальтулозы кристаллизуют по описанной в примере

4 схеме, Из 100 кг раствора изомальтулозы получают 37,4 кг изомальтулозы (соответствует выходу 74,83 в расчете на использованное количество сахарозы).

Подлежащее упариванию количество воды составляет 53,2 кг для получения

37,4 кг изомальтулозы или 1,42 кг/кг изомальтулозы.

Пример 6. От перевивки штамма

Serratia plymuthica ATCC 15928 cMt)еают клетки с помощью 10 мл стерильной питательной среды, состоящей иэ 8 кг сиропа с завода по производству саха40 ра, концентрации 653, 2 кг воды от набухания кукурузы„ 0,1 кг (ИН„) НРО, и 89,9 кг дистиллированной воды (при необходимости рН устанавливают 7,2), Эта суспензия служит в кацестве зат45 равочного материала для предкультур в вибрационных колбах емкостью 1 л с 200 мл питательного раствора указанного состава.

После термостатирования в течение 50

30 ч при 29 C проводят инокуляцию с помощью 20 колб (4. л) 16 л питатель". ной среды указанного состава в ферментере емкостью 30 л и ферментируют при 29 С с аэрацией 20 л воздуха/мин 55 и при скорости перемешивания

350 об/мин, Возросшее количество микроорганизмов определяют микроскопи89 l2 ческий методом, После лостижения по меньшей мере 5х10 микроорганизмов/мл ферментацию заканчивают.

Содержимое ферментера переводят в другую емкость (сосуд), rpe смешивают с катионоактивным коагулянтом (как например, PRIMAFLOC® С7...фирмы

Rohm and Haas, филадельфия, CllJA).

Скоагулированные клетки удаляют путем декантации надосадочной жидкости,промывают с помощью 0,1 M фосфатного буфера с рН 7,0 и обезвоживают на центрифуге, Затем массу экструдируют до получения прядей, высушивают на воздухе и размалывают, 60 г просеянной через сито размером 0,3-0,8 мм фракции иэ полученного препарата в течение 10 мин перемешивают в 0,1 -ном растворе глутароваго альдегида, промывают фосфатным буфером 0,1 М, рН 7,0, и декантацией освобождают от надосадочной жидкости.

Определение ферментной активности таким образом обработанных иммобилизованных клеток показывает удельную активность 40 ед/г сухого вещества,.

Иммобилизованные клетки вносят в термостатируемую при 45 С колонну, Объем слоя клеточной массы составляет. примерно 160 смз, Через колонки непрерывно протекает 50 -ный раствор сахарозы со скоростью потока 70 смз/ч, Выходящий из колонки поток продукта имеет следующий состав, г/100 г суxoro вещества:

Глюкоза 3,4 фруктоза 5,7

Сахароза 1,3

Иэомальтулоза 74,4

1-0- -D-глюкопиранозид-.D-фруктоза 15,2

Полученный раствор изомальтулозы кристаллизуют соответственно описанной в примере 4 схеме, Из 50 кг раствора изомальтулозы получают 17,3 кг изомальтулозы (соответствует выходу

69,2i в расчете на использованное количество сахарозы).

Пример 7, Ситовую фракцию

0,3-0,8 мм из полученного согласно примеру 1 препарата перемешивают в течение 30 мин в 0,23-ном растворе цианурхлорида (2,4,6-трихлор-симм,триазин), промывают фосфатным буфером .

0,1 М, рН 7,0 и путем декантации освобождают от надосадочной жидкости.

Определение ферментной активности таким образом обработанных иммобилиэо1512489

14 ванных клеток показывает удельную активность 55 ед/г сухого вещества, В термостатируемую при 40 С колонку вносят столько иммобилизованных кле- . ток, чтобы объем слоя клеточной массы 5 составил t60 смз. Это количество соответствует 60 г сухого вещества.

Через колонку затем непрерывно пропускают 506-ный раствор сахарозы со скоростью потока 30 смз/ч, Выходящий из колонки поток продукта имеет следующий состав, г/100 г сухого вещества:

Глюкоза ф 7

Фруктоза 3,9

Сахароза ОФ7

Изомальтулоза 79,9

1-0-sC-D-глюкопиранозидD-фруктоза 12,8

Полученный таким образом раствор изомальтулозы кристаллизуют соответственно описанной в примере 4 схеме.

Из 50 г раствора изомальтулозы получают 17,8 кг изомальтулозы. Это .соответствует выходу 71,2i в расчете на использованное количество сахарозы.

Пример 8. Из полученного согласно примеру 6 ферментного раствора получают клеточную массу с помощью центрифуги, Эту клеточную массу перемешивают в 83-ном растворе альгината натрия в соотношении 1 ч. клеточной массы на 10 ч. раствора альгината, Полученную таким образом суспензию 35 пропускают через фильеры диаметром

0,8 мм в медленно перемешиваемый 24ный раствор хлорида кальция, При этом образуются гранулы (шарики) альгината кальция, которые содержат включен- 40 ные клетки бактерий. Измерение ферментной активности гранул (шариков) показывает удельную активность 87 ед/г сухого вещества., В термостатируемую при 40 C колонку вносят 160 смз гра- 45 нул (шариков). Это количество сооТ ветствует 45 г сухого вещества. Через колонку непрерывно пропускают 503-ный раствор сахарозы со скоростью потока

50 смз/ч. Выходящий из колонки поток 50 продукта имеет следующий состав, г/100 r сухого, вещества:

Глюкоза 2,1 фруктоза 4,3

Сахароза 20 -, 55

Изомальтулоза 78,3

1-О-о6-D-глюкопира— нозид-D-фруктоза

Полученный раствор .изомальтулозы кристаллизуют соответственно описанной в примере 4 схеме.

Кз 50 кг раствора изомальтулозы получают 17,6 кг изомальтулозы. Это соответствует выходу 70,4> в расчете на использованное количество сахарозы.

Пример 9, Перевивку штамма

Protaminobacter rubrum CBS 574,77 ферментируют аналогично примеру 6.

Содержимое ферментера смешивают с 24-ным раствором хитозана. Скоагулированную при этом клеточную массу обеэвоживают на центрифуге, экструдируют до полученния прядей и высушивают. Затем массу размалывают и просеивают, Ситовую фракцию 0,3-0,8 мм перемешивают в течение 30 мин в 0,2ь-ном растворе цианурхлорида (2,4,6-трихлор-сими.-триазин) промывают фосфатным буфером О,1 М, рН 7,0, и. отделяют от надосадочной жидкости декантацией.

Определение ферментной активности обработанных таким образом иммобилизованных клеток показывает удельную активность 65 ед/г сухого вещества.

В термостатируемую при 40 0 колонку вносят столько иммобилизованных клеток, чтобы объем слоя клеточной массы составил 160 смз. Это количество соответствует 50 r сухого вещества. Через колонку затем непрерывно пропускают

50 -ный раствор сахарозы со скоростью потока 60 смз/ч. Выходящий из колонки поток продукта имеет следующий состав, г/100 r сухого вещества:

Глюкоза 1,3 фруктоза 3,2

Сахароза 1,2

Изомальтулоза 80,6

1-0-K-D-глюкопиранозид-D-фруктоза 13,7

Полученный раствор изомальтулозы кристаллизуют соответственно описанной в примере 4 схеме.

Из 50 г раствора изомальтулозы получают 18, 1 кг изомальтулозы, Это соответствует выходу 72,44 в расчете на использованное количество сахарозы.

Пример 10. Перевивку штамма

Protaminobacter rubrum СББ 574.77 ферментируют аналогично примеру 6.

Содержимое ферментера переводят в другой сосуд, смешивают с водным раствором коагулянта, состоящим иэ катионоактивного коагулянта PRXNAFLO

С7 фирмы Rohm and Haas, филадельфия, 1512489

США) и а оноактивного коагулянта ф1

РКХМЛ1"LOC А10 фирмы Rohm and Haas, Филадельфия СИА, Скоагулировавшие клетки осаждают, декантируют, промывают с помощью 0,1 М Фосфатного буфера, рН 7,0, и обезвоживают на центри" фуге. Кассу затем экструдируют .в жгуты, сушат при 30 С и размалывают °

100 г ситовой фракции 0,3-0,8 мм полученного препарата перемешивают в течение 10 мин в 0,13-ном растворе глутарового альдегида, промывают фосфатным буфером (0,1 Н, рН 7,0) и путем декантации освобождают от надосадочной жидкости. Обработанные клетки имеют удельную активность 65 ед./г сухого вещества.

10 15

Иммобилизованными клетками запол няют термостатируемый при 30 С коло" ночный реактор. Объем слоя клеточной мдссы составляет примерно 300 смз.

Через реактор непрерывно пропускают

503-ный раствор сахарозы со скоростью протекания 180 cM3/÷. Выходящий из

25 реактора поток продукта имеет следую-. щий состав, г/100 г сухого вещества:

Глюкоза 3,1

Фруктоза 4,9

Сахароза 0,8

Изомальтулоза 81,5

1-0-g-D-глюкопиранозидо-D-фруктоза 9,7

Полученный раствор изомальтулозы кристаллизуют соответственно описанной в примере 4 схеме.

Иэ 50 кг раствора изомальтулоэы получают 18,3 кг изомальтулозы, Это соответствует выходу 73,23 в расчете на использованное количество саха.- 40 розы.

Изобретение обеспечивает следующие преимущества: раствор, содержащий изомальтулозу, MoRHQ подвергать крис" 45 таллизации без предварительного выпаривания, благодаря чему достигается значительная экономия энергии; применение иммобилизованных клеток повышает выход изомальтулозы, так как саха-.50 роза не расходуется для обмена ве.". ". ществ бактериальной массы; выход изомальтулозы еще более повышается вследствие того, что вводят чистые растворы сахарозы и поэтому избегают обширного образования мелассы; так как растворы сахароэы с концентрация" ми выше 65 ь микробиологически стабильны, то можно исключить стерилиэацию субстрата; более высокие концентрации субстрата можно вводить в мень-. шем объеме и, таким образом, можно использовать аппаратуру меньших размеров; увеличение бактериальной массы для получения неподвижных клеток происходит при оптимальных условиях развития; для приготовления бактериальной массы можно применять дешевый питательный субстрат, например разбавленный мелассовый раствор.

Формула изобретения

1. Способ получения изомальтулозы, предусматривающий ферментативную изомеризацию раствора сахарозы с помощью клеток Рто апп.поЬас ег rubrum СВБ

574.77 или Serratia plymuthica с пос" ледующим выделением и кристаллизацией целевого продукта, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения выхода и чистоты целевого продукта, изомеризацию осуществляют с использованием иммобилизованных клеток культур Protaminobacter rubrum CBS

574.77 или Serratia plymuthica АТОС

15928, или S, magcescens NCIB 8285 путем непрерывного пропускания 45753-ного раствора сахарозы через pesf

2. Способ по п.l, о т л и ч а ю - шийся тем, что используют иммобилизованные клетки, полученные коагуляцией глутаровым альдегидом или хлористым циануром.

3. Способ по п.l, о т л и ч а юшийся тем, что используют иммобилизованные клетки, полученные коагуляцией катионоактивным коагулянтом, 4. Способ по пп.l и 3, о т л ич а ю шийся тем, что в качестве коагулянта используют хитоэан.

5. Способ по п.l, o т л и ч а юшийся тем, что используют иммобилизованные клетки, включенные в матрицу из альгината"кальция, 6. Способ по п.l, о т л и ч а юшийся тем, что используют иммобилизованные клетки, включенные в

t(-êàррагинановый гель.

7. Способ по п.l, о т л и ч а юшийся тем, что используют иммобилизованные клетки, включенные в волокна диацетат или триацетат це 1люлозы, 8. Способ по п.l, о т л и ч а юшийся тем, что используют иммоl7 1512489 l8 билизованные клетки, полуценные коа- активным коагулянтом или их комбинагуляц1ей анионоактивным или катионо- цией..

Составитель И.Привалова

Редактор А.Огар Техред Л.Сердюкова Корректор B,Êàáàöèé

Заказ 5914/59 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101