Способ очистки суспензии вируса от клеточной днк

 

Изобретение относится к медицине, микробиологии, в частности к производству вакцинных препаратов. Цель изобретения - упрощение способа и повышение степени очистки вирусной суспензии от клеточной ДНК. Для этого к суспензии вируса, выращенного на клетках перевиваемой клеточной линии, добавляют протамин сульфат до концентрации 4±1 мг/мл и затем удаляют образовавшийся преципитат центрифугированием, а надосадок подвергают дополнительной очистке хроматографией или ультрацентрифугированием через слой сахарозы. Итоговая концентрация клеточной ДНК в препаратах, пригодных в качестве парэнтеральных вакцин, не превышает 100 пг/мл. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

15 2050 А1 (19) (11) (511 4 А 61 K 39/00, 39/12, С 12 И 7/00

"JOE("ÙËÌ

М, а 11,1- 1r j(„„qt("!,,!1!

Е,,Ь.!1.1Ä, Г, и

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ с

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

IlQ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21 ) 4 396256/30- 1 3 (22) 24.03.88 (46) 30,12.89, Бюл. Н 48 (71) Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР (72) Е,Н.Терлецкая, Л,Б.Эльберт, А.В.Тимофеев, Ю.Ю,Кусов, Ю.А,Казачков, Ф.А.Амосенко, Ю.В.Свиткин, Ю.Х.Хапчаев, Л.Л.Миронова, Г.Л.Крутянская, М.С.Балаян и В.А.Лашкевич (53) 576.858.616.988(088.8) (56) Slavik. Studies on tick-borne

encephalitis virus I. Pastial purification of virus from rat broun

suspensions. Acta virol. 12: 535-545, 1968.

Изобретение относится к медицине, микробиологии, в частности к производству вакцинных препаратов.

Согласно требованию ВОЗ, содержание клеточной ДНК в вакцинах медицинского назначения, приготовленных на основе вирусных сборов с перевиваемых клеточных линий, жестко лимитируется величиной не более 100 нг на дозу, так как нельзя полностью исключить трансформирующей клетки и онкогенной активности такой ДНК.

Цель изобретения — упрощение способа и повышение степени очистки вирусной суспенэии от клеточной ДНК путем обработки суспенэии протамин сульфатом в концентрации 4 1 мг/мл

2 (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ СУСПЕНЗИИ ВИРУСА

ОТ КЛЕТОЧНОЙ ДНК (57) Изобретение относится к медицине, микробиологии, в частности к производству вакцинных препаратов, Цель изобретения — упрощение способа и повыпение степени очистки вирусной суспенэии от клеточной ДНК. Для этого к суспенэии вируса, выращенного на клетках перевиваемой клеточной линии, добавляют протамин сульфат до концентрации 4 4 мг/мл и затем удаляют образовавшийся преципитат центрифугированием, а надосадок подвергают дополнительной очистке хроматографией или ультрацентрифугированием через слой сахарозы. Итоговая концентрация кле-. точной ДНК в препаратах, пригодных в качестве парэнтеральных вакцин, не превьппает 100 пгlмл. 3 табл. п с последующей ее очисткой ультрацентрифугированием или гельхроматографи- © ей.

<АР

Способ осуществляют следующим образом„ CO

Вирус клещевого энцефалита или ге- Ql о патита А, размноженный при 37 С в течение 48-72 ч или 14 сут соответственно в перевиваемой культуре клеток, пермессивной для вируса и разрешенной для вакцинного производства, концентрируют и очищают от балластных примесей. Для этого используют обычно следующие последовательные процедуры: осветляющее центрифугирование при

5000-10000 х g или фильтрацию через мембранные фильтры с диаметром пор

1532050

200-$00 нм и ультрафильтрацию через мембраны с диаметром пор 5-50 нм.

К полученному концентрату добавляют протамин сульфат до конечной кон5 центрации 411 мг/мл и инкубируют в о течение получаса при 4 С. Образовав- . шийся преципитат удаляют центрифугированием при 4- 12 тыс. x g в течение

30 мин, Остаток клеточной ДНК и протамин сульфат удаляют центрифугированием при 75 тыс. х g в течение 3 ч через 15Х сахарозу или гельхроматографией на сорбентах типа Сефароза 6B

4В; CL-63; CL-4В или кремнезем

MIIC-1000П-МПС-2000П. Количество клеточной ДНК в препаратах на последсьвательных стадиях очистки измеряют методом точечной гибридизации. Чувствительность метода 2,5 пг/мл. В опыте для вируса клещевого энцефалита при выходе вируса порядка 90Х концентрация клеточной ДНК снижается с

1-3 мкг/мл в концентрате до 200400 пг/мл в очищенном препарате полу- 25 фабриката, а после дополнительного разведения до согласованных уровней иммуногенности эта величина составляет менее 100 пг/мл. В случае суспензии вируса гепатита А при том же выходе антигенного материала количество клеточной ДНК снижается до 190 пг/мл.

Пример 1, Очистка суспензии вируса клещевого энцефалита от клеточной ДНК с применением протамин сульфата с последующим ультрацентрифугированием. Вакцинный штамм вируса клещевого энцефалита, размноженный в перевиваемой культуре клеток почек 40 зеленой мартышки (4647) при 37 С в течение 72 ч объемом 3 л с титром инфекционных частиц 10 БОЕ/мл, осветляют центрифугированием при

10 тыс. х g в течение 30 мин, фильт- 45 руют через нитроцеллюлозные мембраны Миллипор НА и концентрируют в

20 раэ на полиядерных мембранах с диаметром пор 50 нм. К вирусному концентрату добавляют протамин сульфат в конечной концентрации 5 мг/мл. После инкубации в течение 30 мин при 4 С о преципитат удаляют центрифугированием при 10 тыс, х g в течение 30 мин.

Надосадок ультрацентрифугируют в

15Х-ном растворе сахароэы при 75 тыс,х

x g в течение 3 ч, Осадок, содержащий вирус клещевого энцефалита, ресуспендируют до исходного объема в

0,1 М фосфатном буфере рН 7,4 с

0,14 M NaC1. В вирусном концентрате, а также в материале осадка определяют количество клеточной ДНК мето" дом точечной гибридизации с ник-транслированной гомологичной ДНК. Содержание ДНК в препарате 200 пг/мл, а после дополнительного разведения до нужного уровня иммуногенности — от 10 до 40 пг в дозе. Степень очистки от клеточной ДНК около 100 тыс. раз, при высоком выходе вирусного антигена более 90Х (табл.1 и 2).

Пример 2. Очистка суспензии вируса клещевого энцефалита от клеточной ДНК с применением протамин сульфата с последующей гельхроматографией. Надосадок после обработки протамин сульфатом и удаления клеточной

ДНК аналогично примеру 1 подвергают гельхроматографии на колонке 5х40 см, заполненной кремнеземом МПС-2000 П.

Для элюции вирусного материала используют среду 199 или О,1 М фосфатный буфер рН 7,4 с 0,14 M NaC1. Содержание ДНК в конечном препарате

300 пг/мл или 14-57 пг в дозе после дополнительного разведения, Пример 3, Очистка суспенэии вируса клещевого энцефалита от клеточной ДНК с применением протамин сульфата в сниженной концентрации. К вирусному концентрату, полученному аналогично примеру 1 добавляют протамин сульфат в концентрации 0 5 мг/мл.

После инкубации в течение 30 мин при о, 4 С преципитат удаляют центрифугированием при 10 тыс. x g в течение

30 мин. Дальнейшие процедуры очистки выполняют аналогично примеру 1. Содержание ДНК в конечном препарате

900 пг/мл или 43-170 пг в дозе после дополнительного разведения, Пример 4. Очистка суспенэии вируса гепатита А с применением протамин сульфата и последующей гельфильтрации. Вирус гепатита А (штамм

НА$-15/4647 или Л-2424) размножают на монослое перевиваемых клеток 4647 при 37 С в течение 21 сут с еженедельо ной сменой среды Суспенэию инфицированных клеток (титр инфекционной ак" тивности 7,5 1g ТкИД /мл: антиген ный титр 1:32-64) в 0,1 М фосфатносолевом буфере рН 7,4+0,2 (ФСБ) подвергают звуковой обработке (Зх20 с) при 14 кГц и осветляют низкоскорост-.. ным центрифугированием (5000 x g, Таблица I

Влияние концентрации протамин сульфата на полноту удаления клеточной ДНК иэ концентрированной суспензии вируса клещевого энцефалита

Концентрация протамин сульфата, мкг/мл, пг/мл

0,5 1 3 5

Материал

Вирусный концентрат до очистки

Вирусный концентрат после обработки протамин сульфатом и центрифугирования через 157 сахарозу

l,2

1 2

1,2

1,2

900

600

400

300

15 .5 мин)„ Супернатант, содержащий вирус, трижды обрабатывают равным объемом охлажденного (О ) фреона-113, интерфазу дополнительно абстрагируют

0,1 M ФСБ и объединяют вируссодержащие водные фазы. Надклеточную жидкость, собранную при сменах среды, концентрируют ультрафильтрацией на мембранах (РТНК фирмы Миллипор, CVIA) и полученный вирусный концентрат объединяют с указанной вируссодержащей водной фазой. Объединенную вирусную суспензию обрабатывают (30 мин, 4 С) протамин сульфатом в конечной концентрации 3 мг/мл, осадок отделяют низкоскоростным центрифугированием (400 х g 10 мин, 4 С), а суспернатант фракционируют на колонке с Сефароэой 4В (Фармация, Швеция), Во фракциях с колонки определяют содержание вирусного антигена и клеточной ДНК (см „табл. 3) .

1I р и м е р 5, Очистка суспензии вируса гепатита А с применением

ДНКазы, протамин сульфата и последующей гельфипьтрацией. Вирусную суспензию, полученную аналогично примеру

32050 6

4, обрабатывают хлороформом, продувают газообразным азотом до полного его о удаления и обрабатывают (37 С, 60 мин) деэоксирибонуклеаэой 1 (Серва, ФРГ)

5 или ДНКазой иэ поджелудочной железы крупного рогатого скота. Дальнейшую обработку протамин сульфатом и фракционирование осуществляют аналогично примеру 4, используя для хроматографии колонку с сорбентом СИП-IM1000.

Формула изобретения

Способ очистки суспенэии вируса от клеточной ДНК, включающий его выращивание на клетках перевиваемой клеточной линии, осветление, концент20 рирование путем ультрафильтрации с последующей хроматографией или центрифугированием в слое сахарозы, о т— л и ч а ю шийся тем, что,.с целью упрощения способа и повышения сте25 пени очистки вирусной суспензии от клеточной ДНК, полученный концентрат обрабатывают протамин сульфатом в конечной концентрации 4б1 мг/мл.

1532050 аблица2

Результаты применения протамин сульфата для очистки концентрированной суспензии вируса клещевого энцефалита от клеточной ДИК

Биологическая активность материала

Количество клеточной

ДИК

Материал

Инфекционные титры БОЕ/мл Ф

Иммуио re нКонцентрация вирусного протективного ан%.%% тигена Е мкг/мл, 7

% пг/доза пг/мл концентрата ность для

Ф Ф + мьяп ей

Вирусный концентрат до очистки

Вирусный концентрат после обработки: протамин сульфата (5 мг/мп) и центрифугирования через 15Х сахарозу (пример 1) протамин сульфата (5 мг/мл) и гельхроматографии на МПС-2000П (пример 2) протамин сульфата (0,5 мг/мл) и центрифугирования через 15Х сахарозу (пример 3) (55-210) 10 3,2 10 (100) 5,7(100) 1,2 10

100

2,9 1О (90) 5IZ(90) l0-4О

200

3,0 10 (90) 5,3(90) 93

14-57

300

900

2,9 10 (90) 5,2(90) 43-170

Ф

Количество препарата, достаточное для получения имунного ответа у человекасоответствует примерно 50 МИЛ (минимальных иммуниэирующих доэ, защищающих мышей от смертельного заражения вирусом кл, энцефалита) или 0,25-1,0 мкг протективного антигена Е в составе вирионной вакцины на 1 ииьекцию, ьf

Титрование методом бляшек на культуре СПЭВ.

1 с

Метод электрофореэа с использованием стандартного антигена Е.

ФВ1Ф

Определяют,ло количеству МИДо в 1 мл препарата с поправкой на разведение материала.

Таблица 3

Результаты обработки протамин сульфатом суспензии вируса гепатита А

Препарат

Антигенная активность ОП49

Содержание клеточной ДНК во всем % пг/мл объеме

Пример 4

Исходная вирусная суспензия

Очищенный препарат ВГА

Пример 5

Исходная вирусная суспензия

Препарат ВГА, очищенный обработкой ДНКазой и протамин сульфатом

IDIO 1OO

4,65

I0O

9х10

Iх10

4,10

5х10 100

6,15

100 с 2х10

6,25

102 сс