Способ определения степени активности воспалительного процесса при хронических бронхитах

 

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения степени активности воспаления при хронических бронхитах. Целью изобретения является повышение точности способа. Для этого у больных хроническим бронхитом натощак забирают мокроту, гомогенизируют ее, разбавляют в 2 раза физиологическим раствором, добавляют 1%-ный раствор тритона Х-100 в количестве, равном 1/10 от объема пробы, охлаждают и центрифугируют 20 мин при 5000 об/мин. В надосадке определяют активность катепсинов по расщеплению ими гемоглобина. Для этого к 0,1 мл супернатанта приливают 1,0 мл раствора, содержащего 20 мг/мл гемоглобина в ацетатном буфере, с PH 4,0 с добавлением 120 мг/мл мочевины. Пробирку инкубируют в закрытом виде 1 ч при 37°С, приливают 2,0 мл 4%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин 15 мин. Контрольная проба от опытной отличается тем, что в контроле @ 0,1 мл супернатанта мокроты вносится в пробирку после добавления трихлоруксусной кислоты. В пробах определяют оптическую плотность при длине волны 280 нм и рассчитывают активность катепсинов по формуле A = E/к<SP POS="POST">.</SP>C, где A - активность катепсинов в мокроте, выражается в нМ тирозина/ч<SP POS="POST">.</SP>мг белка

К - коэффициент калибровки, равный 0,42

C - концентрация белка в пробе, мг

E-единицы экстинции. При показателях A меньше 130 нМ тирозина/ч<SP POS="POST">.</SP>мг белка устанавливают I степень, 130-260-II степень и с

Сбоз СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„Я0„„1543345 (51)5 С 01 М 33/68

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР (21) 4239165/28-14 (22) 28.04.87 (46) 15.02.90. Бюл. № 6 (71) Рязанский медицинский институт им. И.П.Павлова (72) С.С.Якушин и Е.А.Строев (53) 616.07(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР № "1127569, кл. А 61 В 10/00, 1984. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ АКТИВНОСТИ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ПРОЦЕССА ПРИ

ХРОНИЧЕСКИХ БРОНХИТАХ (57) Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения степени активности воспаления при хронических бронхитах.

Целью изобретения является повышение точности способа. Для этого у больных хроническим бронхитом натощак забирают мокроту, гомогенизируют ее, разбавляют в 2 раза физиологическим раствором, добавляют 1%-ный раствор тритона Х-100 в количестве, равном

1 /10 от объема пробы, охлаждают и . центрифугируют 20 мин при 5000 об/мин.

В надосадке определяют активность катепсинов по расщеплению ими гемоглобина. Для этого к 0,1 мл супернатанта приливают 1,0 мл раствора, соИзобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, . и может быть использовано для опреде- ления степени активности воспалительного процесса при хронических бронхитах.

2 держащего 20 мг/мл гемоглобина в ацетатном буфере, с рН 4,0 с добавлением

120 мг/мл мочевины, Пробирку инкубиру

0 ют в закрытом виде 1 ч при 37 С, приливают 2,0 мл 4%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин 15 мин.

Контрольная проба от опытной отличается тем, что в контроле 0,1 мл супернатанта мокроты вносится в пробирку после добавления трихлоруксусной кислоты. В пробах определяют оптическую плотность при длине волны 280 нм и рассчитывают активность катепсинов по формуле А=Е/К С, где А — активность катепсинов в мокроте, выражается в нИ тирозина/ч мг белка; К вЂ” коэффициент калибровки, равный 0,42; Сконцентрация белка в пробе, мг;

Š— единицы экстинции, При показателях А меньше 130 нМ тирозина/ч мг белка устанавливают I степень,,130—

260 — II степень и свыше 260 — III степень активности воспалительного процесса, Использование изобретения позволяет назначать адекватное индивидуальное лечение и следить за его эффективностью. При этом метод имеет высокую точность — до 87-93% совпадений с известными методами, являясь простым и безопасным для больного.1 табл.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Способ осуществляют следующим обр аз ом.

Иокроту забирают у больных натощак после санации ротовой полости и гомо1543345 ген изируют в стеклянной пробирке с тефлоновым пестиком с частотой вращения 200 об/мин в течение 20 мин. Гомогенат мокроты переносят в мерную центрифужную пробирку, приливают равное количество охлажденного физиоло-. гического раствора и тщательно пере-. мешивают, Добавляют в количестве, равном 1/10 от общего гомогената, 1Х-ный раствор тритона Х-100, перемешивают и оставляют в холодильнике на 15 мин, а затем центрифугируют при

5000 об/мин в течение 20 мин.

В две пробирки (опыт и контроль) берут по 1,0 мл субстратного раствора. В опытную пробирку приливают

0>1 мл (супернатанта), затем обе пробирки закрывают стеклянными пробками и инкубируют 1 ч при 37 С. После инкубации в обе пробирки приливают

2,0 мл 4%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и в контроль приливают 0,1 мл надосадочной жидкости. Центрифугируют при 25

3000 об/мин в течение 15 мин. Измеряют оптическую плотность в надосадке при длине волны 280 нм. Определяют активность катепсинов в расчете на содержание белка в йадосадочной жидкости по формуле

Е

А=—

KG" где Š— единицы экстинции;

К вЂ” коэффициент калибровки (К=

=0,42);

С вЂ” содержание белка в пробе (0,1 мл). мг (измеряется в

-(-( нИ тирозина ч ° мг белка.

Используют следующие реактивы для определения катепсинов.

1. Субстратный раствор, 4,8 г мочевины растворяют в 6,2 мл дистиллированной воды, добавляют 800 мг гемоглобина, тщательно перемешивают ° В закрытой стеклянной посуде инкубируют

2 ч при 60 С. Затем к раствору при ливают 30 мл ацетатного буфера рН 4,0.

2, Ацетатный буфер рН 4,0. Берут

73,4 мл 1 N уксусной кислоты и приливают 50 мл 1 N едкого натра и дово- 5ц дят объем до 500 мл дистиллированной водой.

Пример 1. Больная В., 40 лет, поступила с жалобами на кашель с от55 делением вязкой светло-зеленой мокроты около 100 мл/сут., одышку при физической нагрузке. Страдает хроническим бронхитом 14 лет с ежегодными обострениями, настоящее обострение последние 3 недели. При поступлении состояние удовлетворительное, температура тела — 36, 8О С. В ле гких легочный звук, дыхание везикулярное, с обеих сторон грубые сухие хрипы. Со стороны других органов патологии не выявлено. На рентгенограмме органов грудной клетки с обеих сторон легочный рисунок усилен, перестроен, фиброэные изменения корней легких, При бронхо скопии обнаружено: слизистая оболочка бронхов обоих легких гиперемирована, рыхла, просвет бронхов сужен за счет рыхлой, отечной слизистой. Отделяемое слизисто-гнойное. При спирографии изменений функции внешнего дыхания не выявлено: БЕЛ вЂ” 3,8 л — 107%

ДЖЕЛ; ИОД вЂ” 16 л — 115Х ДЫОДр ИВЛ—

61,6 л — 83% ДИВЛ; ФЫЕЛ(— 2,33 л, индекс Тиффно — 75%. Пневмотахометрия выдоха — 3,9 л/с, Общий анализ крови: эритроциты 4,6 "10 /л; гемоглобин (2.

150 г/л; лейкоциты — 7,9 10 /л; лейкоцитарная формула без изменений;

СОЭ вЂ” 8 мм/ч, Биохимическое исследование крови: СРБ — отрицательный; сиаловые кислоты — 2,3 ммоль/л; серомукоид — 0,13 ед.; фибриноган — 2,4 г/л; альбумины — 47%; глобулины — 7,7Х;

L — 11,3%; Я вЂ” 13%; — 21%. Иммуноглобулины крови: IgA — 1,91 г/л; Тф10,99 г/л; IgL — 13,4 г/л, Общий анализ мокроты: слизисто-гнойная, вязкая лейкоциты 30-40 в поле зрения, Общая активность катепсинов в мок-в роте составила 465,3 нИ тирозина ч мг белка. Клинический диагноз: хронический гнойный необструктивный бронхит в фазе обострения, III степень активности. Перибронхиальный пневмосклероэ.

Назначенное лечение (гентамицин, санационные бронхоскопии с введением

0,1Х-ного раствора фурагина Р 5, пресоцил, аутогемотерапия, эуфиллин,. отхаркивающая микстура с термопсисом) принесло значительный клинический эффект: значительно уменьшился кашель, количество мокроты около 25 мл/сут., светлая. В легких исчезли сухие. хрипы. При бронхоскопии отмечена положительная динамика: значительно уменьшилась гиперемия, отечность слизистой бронхов, остается небольшое количество слизисто-гнойного отделяемого единичными мазками. Активность катепсинов мокроты уменьшилась до 88,6 нИ

5 15 тирозина ч мг белка. На 17-й день больная выписана из стационара.

В данном примере наиболее информативными методами в оценке степени ак-. тивности воспаления явилась бронхоскопия и исследование катепсинов мокроты, Установление III степени активности воспаления в данном примере предопределило интенсивность антибактериального и противовоспалительного лечения с применением санационных бронхоскопий. Значительное улучшение состояния больной и уменьшение активности воспаления в бронхах четко коррелирует с уменьшением активности катепсинов в мокроте более, чем в 5 раз.

Пример 2. Больной М., 52 г., поступил с жалобами на приступообразный кашель с оделением слизисто-гнойрой мокроты около 150 мл/сут, одышку в покое и при небольшой физической нагрузке временами приступообразного характера. Страдает хроническим бронхитом более 20 лет с практически ежегодными обострениями, Бронхообструктивный синдром около 8 лет, год назад диагносцированы бронхоэкстазы.

Настоящее обострение в течение последних двух недель. При поступлении состояние удовлетворительное, температура тела — 36,7 С. Акроцианоэ губ.

Число дыханий — 24 в 1 мин. Грудная клетка бочкообразная, перкуторно-легочный звук с коробочным оттенком, жесткое везикулярное дыхание, в большом количестве грубые и свистящие сухие хрипы на вдохе и выдохе; выход несколько удлинен. Тоны сердца приглушены, ритм правильный, частота пульса — 100 уд./мин, артериальное давление — 170/110 мм рт.ст. Печень не пальпируется. Отеков нет. На рентгенограмме органов грудной клетки легочная ткань повышенной прозрачности, усиление и перестройка легочного рисунка по ячеистому типу. Бронхоскопия не проводилась иэ-за сопутствующеи гипертонической болезни 11Б стадии. При исследовании функции внешнего дыхания определяютая резкие изменения по обструктивному типу:

МОД вЂ” 21,1 л — 210Х ДИОД; ЖЕЛ вЂ” :

2,51 л — 637. ДХ(ЕЛ; ИВЛ вЂ” 35,2 л — 35X

ДИВЛ; ФМ(ЬЛ, — 0,97 л; индекс Тиффно—

38Х. Пне вм отахоме трия выдоха—

1,1 л/с. ЭКГ: синусовый ритм, откло:нение электрической оси сердца впра43345

40 во. Гипертрофия правого предсердия.

Общий анализ крови: эритроциты—

4,3 ° 10 /л; гемоглобин — 132 г/л, лейкоцить. — 4,4 ° 101/л, лечкоцитарная формула без изменений; СОЭ вЂ” 10 ми/ч.

Биохимическое исследование крови: альбумины — 49,3 i; глобулины: Ь вЂ”

Ь,1/, Ь вЂ” 10,51, Р- 14,11, 20,01, С1 Б ++, сиаловые кислоты2,87 ммоль/л, серомукоид - 0,27 ед.:

Иммуноглобулины крови: IgA — 0,54 гй;

IgM — О, 12 г/л; IgC. — 20,7 г/л. Общий анализ мокроты: светло-желтая, слизистая, лейкоцитов много в поле зрения.

Общая активность катепсинов в мокроте составила 201,8 нМ тирозинак ч тамг белка.

Основной клинический диагноз: хронический гнойнообструктивныи бронхит с бронхоэктазами в фазе обострения, II-я степень активности. Диффузная эмфизема легких. Пневмосклероз. После проведенной терапии (диоксицин, фурагин, теофедрин, теоникол, ингаляция с эуфиллином и эфедрином, отхаркивающая микстура с термопсисом, массаж грудной клетки, кальций и эуфиллин, электрофорез на грудную клетку) самочувствие больного улучшилось: уменьшился кашель, количество мокроты — до 50 мл/сут, В легких количество сухих хрипов значительно уменьшилось, Пневмотахометрия выдоха увеличилась до 2,4 л/с. В общем анализе крови без патологии. Активность катепсинов в мокроте уменьшилась более, чем в 2 раза — до 98,4 нМ тирозина т ч мг белка. Больной выписан из стационара на 19-й день лечения.

В данном клиническом примере установление II.— и степени активности воспаления на основании клинических и лабораторно-биохимиЧеских признаков предопределило менее интенсивную про" тивовоспалительную терапию, чем в предыдущем случае.

П р им е р 3. Больной С., 51 г., поступил с жалобами на кашель с мокротой светло-желтого цвета около

70 г/сут,, небольшие боли справа в грудной клетке, потливость, температура до 38 С. Страдает хроническим бронхитом около 8 лет, настоящее обострение около месяца. При поступлении состояние удовлетворительное.

Температура тела 37,5 С Число дыханий — 18 в 1 мин. Грудная клетка ци1543345.линдрическая. Перкуторно-легочный звук с коробочным оттенком, при аускультации жесткое везикулярное дыхание. Хрипов нет. Тоны сердца приглу5 шены, ритм правильный, не грубый сис- 1 толическМ шум на верхушке, частота пульса 62 уд./мин, артериальное давление 115/75 мм рт.ст. Печень не

;Пальпирувтся. Отеков нет. На рентгенограмме органов грудной клетки: легочный рисунок в прикорневых зонах

Перестроен с участками склероза, корни малоструктурны, справа в верхней доле ограниченный фиброз. При исследовании функции внешнего дыхания определяются начальные изменения по смешанному типу: ЖЕЛ вЂ” 2,95 л — 86%

ДЖЕЛ; ИВЛ вЂ” 63,4 л — 74% ДИВЛ; ФЖЕЛ»

2,24 л, индекс Тиффно — 76%. БронхоСкопия (на 11-й день лечения): слизистая оболочка бронхов легких обоих умеренно гиперемирована. Отделяемое

Скудное светлое в бронхах обоих легких. ЭКà — суносовый ритм, нормаль- 25 ное положение электрической оси сердца.,Общий анализ крови: эритроциты—

4-,3 ° 10 /л; гемоглобин — 140 г/л; лейкоциты — 7,5 ° 10 /л; лейкоцитарная формула без изменений; СОЭ вЂ” 10 мм/ч. 30

Виохимическое исследование крови:

СРБ - отрицательно; сиаловые кислоты1,8 ммоль/л; серомукоид 0,14 ед. Иммуноглобулины крови: IgA — 2,73 г/л;

LgM — 0,9 г/л; IgG — 23,5 г/л. Общий

35 анализ мокроты: светлая, вязкая, слизистая, лейкоциты 4-5 в поле/зрения, Макрофаги — 0-2, грамположительные кокки — немного, грамотрицательные палочки — умеренное количество.

Общая активность катепсинов в мок,роте составила 102,3 нМ тирозина4 кч, мг белка, что соответствует

I-й степени активности воспаления.

Основной клинический диагноз: хрони ческий бронхит в фазе обострения, I ÿ степень активности. Пневмосклероз. Дыхательная недостаточность 01 ст. После проведенного лечения (мономицин, сульфален, бутадион, алое, отхаркивающие средства, индуктотермия на грудную клетку, массаж грудной клетки) самочувствие значительно улучшилось: жалоб HBT температура тела нормальная. В легких хрипов нет. Выписан иэ стационара в удовлетворительном состоянии на 17-й день лече,ния.

Предлагаемый способ диагностики бып применен у 54 больных хроничес-

I ким бронхитом, из них по критериям

И.И.Ииррахимова, Н.Н. Бримкулова I-я степень активности определялась у 16;

II-я — у 23 и III-я — у 15 больных.

Активность катепсинов в мокроте у больных хроническим бронхитом состаI вила (NiM) при активности воспаления

I-й степени — 54,9+6,0 нИ тирозина ч тамг белка, 1

1Х-й степени — 196,9+13,4 нИ ти1 розина ч . мг белка, III-й степени — 440,2+29,1 нИ

1 -! тирозина.ч мг белка.

При определении граничных значений по формуле N+25 для каждой из трех групп обследованных получается частичное наложенИе определяемых интервалов как между I и II, так и меж ду II u III группами. Однако, учитывая высокодостоверную разницу (P (0,001) между средними величинами каждой из групп обследованных, возможно определение крайних значений для Т? группы обследованных с дополнительной поправкой на величину, раную 3 мб (м»- — ошибка сигмы) с достоверностью Р<0,001.

Итак, при м = 26=9,8 нижняя граница для второй группы равна И,„ -2G+

+Зим=131,1 = 130 расч. ед., верхняя граница — И „ +26-3мо,=262,3 260 расч. ед.

Таким образом, со значимостью P <

<0,001 можно утверждать, что нижнее граничное значение для II группы будет 130, а верхняя граница — 260.

С целью объективизации оценки активности катепсинов мокроты как показателей активности воспаления при хронических бронхитах было проведено определение ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Для ве-. рификации результатов исследования катепсинов в качестве эталона сравнения использовались клинико-эндоскопические критерии активности воспаления. Результаты приведены в таблице.

Приведенные данные свидетельствуют о высоком проценте истинно положи- тельных результатов активности катепсинов мокроты в каждой группе обследованных.

Таким образом, более точное уста новление степени активности воспалительного процесса методом исследования катепсинов в мокроте при хрони-

Степень активности воспаления при хроническом бронхите

Показатели сравнения (zzz

Ложи ойоложительные

Ложноотрицательные

Истинно положительные

8,71

4,3%

87,,0Х (0,001

6,3%

6,7Х

93,3Х (0,001

93,7Х (0,001

II p и м е ч а н и е. P — достоверность между истинно положительными и ложнопо-ложительными и ложноотрицательными результатами.

Составитель A,ßõüÿåâ.Редактор А.Лежнина Техред А. Кравчук Корректор М. Кучерявая

Заказ 398

Тираж 506

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 10!

9 1543345 1 0 ческих бронхитах позволяет назначить хронических бронхитах путем биохимииндивидуальную адекватную терапию при ческого исследования мокроты, о т " обострении заболевания, определяет личающийся тем,что,сцеинтенсивность и длительность противо- . лью повынения точности способа, опре5 воспалительнои и антибактериальной деляют уровень активности катепситерапии. Способ также позволяет конт- нов и при его значении 130 нИ тирози.ролировать эффективность лечения, на/ч мг белка и менее определяют и является простым и полностью 6e3o I степень, 131-260 нИ тирозина/ч.мг пасным для больного. белка — II степень, а более 260 нИ ф о р м у л а и з î б р е т е н и я тирозина/ч.мг белка — III степень

Способ определения степени актив- активности воспалительного процесности воспалительного процесса при са.