Гидрохлорид 1- циклопропил -6- нитро-7-(4-метилпиперазинил) -4- оксо -1,4- дигидрохинолин -3-карбоновой кислоты, обладающий антибактериальной активностью

 

Изобретение касается гетероциклических соединений, в частности гидрохлорида 1-циклопропил-6-нитро-7-(4-метилпиперазинил) -4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты, обладающего антибактериальной активностью, что может быть использовано в медицине. Цель - получение нового более эффективного соединения указанного класса. Синтез целевого соединения ведут добавлением спиртового раствора hCl до рН 1 к 1-циклопропил-6-нитро-7-(4-метилпиперазинил) -4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоте. Выход 91%, т. пл. 271 - 272°С, брутто ф-ла C₁₈H₁₀N₄O₅·HCl . При токсичности 580 мг/кг для нового соединения, например, на модели септикопиемии, вызванной Ps. aeruginosa, в дозах 100, 200, 400 мг/кг выживаемость животных составляет 85 - 90% против 10 - 20% для известного структурного аналога. 9 табл.

Изобретение относится к новым производным 4-хинолон-3-карбоновой кислоты, а именно к гидрохлориду 1-циклопропил-6-нитро-7-(4-метилпиперазинил)-4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-кар бонокислоты формулы I HCl обладающему антибактериальной активностью. Цель изобретения - получение нового производного в ряду 4-хинолон-3-карбоновой кислоты, обладающего улучшенной антибактериальной активностью по сравнению со структурным аналогом, проявляющим тот же вид биологической активности. П р и м е р 1. Получение гидрохлорида 1-циклопропил-6-нитро-7-(4-метилпиперазинил)-4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-кар бонокислоты (Ia). а. Получение исходного соединения - 1-циклопропил-6-нитро-7-хлор-4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты. К 33,7 г (0,1 моль) этилового эфира 1-циклопропил-6-нитро-7-хлор-4-оксо-1-4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты прибавляют 100 мл концентрированной соляной кислоты и 10 мл уксусной кислоты и кипятят с обратным холодильником 1 ч. Смесь охлаждают, осадок отфильтровывают, промывают на фильтре водой (2×50) и очищают кристаллизацией из ДМФА. Получают 25,3 г (82%) 1-циклопропил-6-нитро-7-хлор-4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты, т.пл. 266-267^оС. Найдено, %: С 50,51; Н 3,02; N 9,07; Сl 11,54. С₁₃Н₉СlN₂O₅. Вычислено, %: С 50,58; Н 2,94; N 9,08; Cl 11,49. ИК-спектр, см^-1: 1730 (СООН), 1610 (С=О, С=С), 1520 (NO₂). Масс-спектр, m/z: М⁺ 308. Б. Получение 1-циклопропил-6-нитро-7-(4-метилпиперазинил)-4-оксо-1,4-дигидро-хинолин-3-ка рбонкислоты. К 30,8 г (0,1 моль) 1-циклопропил-6-нитро-7-хлор-4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-ка- рбоновой кислоты в 200 мл ДМФА прибавляют 45 мл 30%-ного водного раствора N-метилпиперазина (0,15 моль) и смесь кипятят (130-140^оС) в течение получаса. Смесь охлаждают, доводят рН раствора до нейтральной реакции (лакмусовая бумажка), экстрагируют хлористым метиленом (3×100), сушат над сульфатом магния и отгоняют под вакуумом досуха. Остаток очищают кристаллизацией из ДМФА. Получают 27,5 г (74%) 1-циклопропил-6-нитро-7-(4-метилпиперазинил)-4-оксо-1,4-дигидрохино-лин-3-ка рбонкислоты в виде кристаллического порошка красно-оранжевого цвета, т.пл. 260-261^оС. Найдено, %: С 58,11; Н 5,39; N 15,01. С₁₈Н₂₀N₄O₅. Вычислено, %: С 58,06; Н 5,41; N 15,05. ИК-спектр, см^-1: 1720 (СООН), 1610 (С=О, С=О), 1510 (NO₂). Масс-спектр, m/z: М⁺ 372. В. Получение целевого продукта. К 37,2 г (0,1 моль) 1-циклопропил-6-нитро-7-(4-метилпиперазинил)-4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-кар бонокислоты прибавляют спиртовой раствор соляной кислоты до рН 1 при комнатной температуре. Смесь перемешивают 1 ч, осадок отфильтровывают, промывают на фильтре спиртом, очищают кристаллизацией из ДМФА. Получают 37,1 г (91%) гидрохлорида 1-циклопропил-6-нитро-7-(4-метилпиперази- нил)-4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоно- вой кислоты в виде темно-желтого кристаллического порошка, т.пл. 271-272^оС. Найдено, %: С 52,84; Н 5,26; N 13,71; Сl 8,76. С₁₈Н₂₀N₄O₅ HCl. Вычислено, %: С 52,87; Н 5,18; N 13,70; Сl 8,68. ИК-спектр, см^-1: 1725 (СООН), 1610 (С=О, С=С), 1505 (NO₂). Предлагаемое соединение исследовано на антибактериальную активность по следующим показателям: в опытах in vitro в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий (см. табл. 1-3); в опытах in vivo на белых мышах при инфекциях, вызванных возбудителями острых бактериальных заболеваний, на моделях с внутрибрюшинным заражением (опыты с синегнойной и брюшнотифозной палочками и стафилококком) и на модели с внутримозговым заражением - гнойный менингоэнцефалит мышей, вызванный синегнойной палочкой, (см. табл. 4-7); в модельных опытах in vitro с целью изучения влияния соединения Ia на уровень угнетения синтеза ДНК в клетках кишечной палочки (см. табл. 8); в модельных опытах in vitro со стафилококком с использованием метода электронной микроскопии с целью изучения влияния соединения Ia на ультраструктуру бактериальной клетки (см. табл. 9); в опытах на интактных животных оценивали переносимость и токсичность соединения Ia при введении peros, под кожу и внутрибрюшинно. Активность соединения Ia сравнивали с активностью структурного аналога (А) 1-этил-6-нитро-7-(4-метилпиперазинил)-4-ок- со-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты, а в опытах in vivo при оценке влияния на уровень ДНК и оценке токсичности также и с активностью оксолиниевой кислоты (1-этил-6,7-метилендиокси-4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновая кислота). Изучение активности соединения Ia в опытах in vitro. Активность in vitro изучена в трех сериях опытов в отношении 11 видов патогенных и условно-патогенных бактерий. Всего использовано 56 штаммов, в том числе референс-штаммы и ряд клинических штаммов. В первой серии опытов (см. табл. 1) антибактериальная активность соединения Ia изучена в отношении пяти референс-штаммов на жидкой питательной среде (бульон Хоттингера, 120 мг% аминного азота) методом двукратных серийных разведений с предварительным растворением веществ в диметилформамиде. Инокулят - 1×10⁵ колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл среды. Величину минимальной подавляющей концентрации (МПК) оценивали через 18-20 ч после культивирования при 35-37^оС. Как видно из табл. 1, соединение Ia высокоактивно in vitro в отношении всех пяти видов бактерий (МПК 0,5-3,9 мкг/мл). Наибольший интерес представляет высока активность (МПК 1-2 мкг/мл) в отношении Ps.aeruginisa, S.aureus, Bac.subtilis, cущественно превышающая активность этильного аналога. Во второй серии экспериментов (см. табл. 2) оценивали активность соединения Ia в отношении трех видов бактерий на примере высоковирулентных штаммов, используемых для воспроизведения инфекции in vivo. Опыты проводили методом серийных двукратных разведений на жидкой питательной среде; величина инокулята в 10 раз выше (1х10⁶ КОЕ/мл), чем в первой серии опытов. В опытах со стафилококком эксперименты проведены с четырьмя клиническими высоковирулентными штаммами, в том числе три штамма (178, 191, 18б) - полирезистентные, устойчивые к метилциллину и оксациллину. Как видно из табл. 2, соединение Ia высокоактивно (МПК 0,25-3,9 мкг/мл) в отношении высоковирулентных штаммов S.typhi, Ps.aeruginosa и S.aureus при высокой микробной нагрузке и превосходит по активности этильный аналог. Кроме того, активность соединения Ia сравнительно с этильным аналогом (А) изучена в четырех экспериментах в отношении ассоциации Ps.aeruginosa 165 и S.aureus 178 при величине инокулята 1×10⁸ КОЕ/мл (т.е. 5х10^- КОЕ/мл каждого штамма). Для соединения Ia МПК=1,95 мкг/мл (т.е. та же величина, что и в эксперименте с монокультурой и меньшей микробной нагрузкой); для этильного аналога в опытах с ассоциацией бактерий МПК 15,6-31,2 мкг/мл. В следующей серии опытов (см. табл. 3) оценка активности соединения Ia сравнительно с аналогом А проведена на твердой агаризованной среде. Использован агар АГВ, метод серийных двукратных разведений, посев бактерий - с применением штамма-репликатора по Steers; концентрация микробных клеток в пятне при посеве репликатором 10⁴ КОЕ/мл. Опыты проведены с 48-ю клиническими и эталонными штаммами бактерий. Посевы инкубировали при 35-37^оС 18-20 ч. Как видно из табл. 3, соединение Ia характеризуется высокой активностью в опытах с большинством из изученных штаммов: МПК 0,25-2 мкг/мл. Несколько меньшая активность отмечена в отношении некоторых штаммов E.сoli и Ps.aeruginosa (МПК 15,6-31,2 мкг/мл). В опытах со стафилококком и спорообразующими грамположительными аэробными бактериями (Bac.subtilis и Bac.cereus) соединение Ia превосходит аналог А; в опытах с Е.coli, Кl.pneumoniae и Ps. aeruginosa значения МПК для 50% штаммов (МПК 50%) существенно ниже, чем этот же показатель для аналога А. Соединение Ia значительно более активно, чем аналог, в отношении иерсиний (I.enterocolotoca и I.pseudotubercul). Изучение активности соединения Ia в опытах на моделях острых бактериальных инфекций белых мышей (см. табл. 4-7). Опыты проведены с Ps.aeruginosa, 165, S.typhi 446 и S.aureus 178 и 1530 белых беспородных мышах массой 15-16 г на моделях острых бактериальных инфекций с внутрибрюшинным заражением животных и заражением интрацеребрально. Использовали инфицирующие дозы, вызывавшие гибель 80-100% контрольных нелеченных животных через 24-48 ч после заражения. Соединение Ia вводили per os или под кожу; этильный аналог per os (основание) или под кожу (хлоргидрат); оксолиниевую кислоту (нерастворимое соединение) вводили per os. Изучали активность перечисленных веществ в диапазоне доз 6,25-600 мг/кг однократно при условии введения через 30 мин после заражения. Длительность наблюдения за животными 10 сут. Оценку активности проводили на основании выживаемости и продолжительности жизни леченых животных. Кик видно из табл. 4, соединение Ia высокоактивно на модели септикопиемии мышей, вызванной Ps.aeruginosa как при введении под кожу, так и при введении внутрь; при подкожном введении более активно. Соединение Ia существенно превосходит по активности этильный аналог: выживаемость животных при применении оптимальных доз соединения Ia per os более 80%, при применении per os аналога (А, основание) только 20-25%. Соединение Ia высокоактивно на модели септикопиемии, вызванной Ps.aeruginosa, при парентеральном введении - под кожу. В оптимальных дозах 100-200-400 мг/кг однократно выживаемость животных составляла 85-90%, в дозе 50 мг/кг достигался 60%-ный защитный эффект. Учитывая слабую активность этильного аналога А в опытах in vivo в отношении инфекции, вызванной Ps. aeruginosa, и очень высокую активность соединения Ia на этой модели, сравнения активности аналога с соединением Ia при парентеральном введении не проводили. Высокая активность соединения Ia в отношении инфекции, вызванной Ps.aeruginosa, установлена также в дополнительном эксперименте на модели гнойного менингоэнцефалита (см. табл. 5). Выживаемость животных при условии только однократного лечения составила 50-80% в зависимости от величины лечебной дозы. Соединение на этой модели существенно продлевает жизнь леченых животных. По показателю суммарной продолжительности жизни (в % к максимально возможной при данных условиях опыта) эта величина для соединения Ia составляла 62-83%. Как видно из табл. 6, соединение Ia оказалось высокоактивно на модели септицемии мышей, вызванной S.typhi. Соединение при парентеральном введении существенно превышает этильный аналог, который высокоэффективен только в дозах от 200 мг/кг и выше, и оксолиниевую кислоту, которая оказывает высокий химиотерапевтический эффект, начиная с дозы 100 мг/кг. Соединение Ia на модели брюшнотифозной инфекции мышей высокоэффективно, начиная с доз 6,25-12,5 мг/кг; выживаемость соответственно 80-100% леченых животных при гибели всех нелеченных контрольных мышей. Как видно из табл. 7, соединение Ia проявляет химиотерапевтическую активность при экспериментальной стафилококковой инфекции как при введении под кожу, так и при введении per os. На данной модели соединение Ia эффективно в дозах 200-400 мг/кг однократно при подкожном введении и в дозах 100-400 мг/кг при введении per os. По показателю выживаемости превосходит по активности оксолиниевую кислоту при введении под кожу и per os в дозе 200 мг/кг и при введении per os - в дозе 100 мг/кг. Изучение влияния соединения Ia на биосинтез ДНК. В опытах in vitro с E.coli (штамм К-12) на модели репликации ДНК изучено влияние соединения Ia на биосинтез ДНК сравнительно с оксолиниевой кислотой и этильным аналогом (А, основание). Использовали культуры E.coli К-12 в фазе логарифмического роста. Состояние биосинтеза ДНК оценивали по включению ³Н-тимидина в кислотонерастворимую фракцию клеток Е.coli. Культуру E.coli К-12 выращивали на синтетической среде до содержания 5х10⁸ КОЕ/мл, охлаждали до 0^оС (для остановки роста), добавляли ³Н-тимидин для конечной концентрации 2 мкг/мл, инкубировали с соединением Iа или с этильным аналогом, или с оксолиниевой кислотой в концентрациях 0,1; 1; 10 и 100 мкг/мл в течение 30 мин при 37^оС с встряхиванием. После окончания инкубации отбирали пробы (по 1 мл), к которым добавляли 1 мл (10%-ной трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Пробы фильтровали (на миллипоровых фильтрах), высушивали и помещали во флаконы с толуольным сцинтиллятором. Радиоактивность проб измеряли в жидкостно-сцинтилляционном счетчике "Delta" (Тracor, США) на основании специально разработанного жидкостно-сцинтилляционного метода измерения радиоактивности ДНК в присутствии 6-нитропроизводных хинолонкарбоновой кислоты. Уровень ингибирования биосинтеза ДНК определяли по снижению включения ³Н-тимидина. Как видно из табл. 8, соединение Ia является высокоактивным ингибитором синтеза ДНК E.соli К-12 и существенно превосходит по степени ингибирования оксолиниевую кислоту, являющуюся высокоактивным ингибитором ДНК, и этильный аналог. Изучение влияния соединения Ia на ультраструктуру бактериальной клетки. С использованием электронной микроскопии изучено влияние соединения Ia на ультраструктуру клеток стафилококка сравнительно с этильным аналогом (хлоргидрат) и оксолиниевой кислотой. Суточную культуру клеток стафилококка (штамм S.aureus 178, полирезистентный, высоковирулентный для мышей) подвергали воздействию соединений Ia, А (хлоргидрат) и оксолиниевой кислоты при концентрации микробных клеток в среде 1×10⁶ КОЕ/мл, исследовали влияние указанных выше соединений в концентрациях 1,5 и 10 мкг/мл. Ультраструктурные изменения в клетках стафилококка изучали в динамике при экспозиции 24, 48, 72 и 96 ч. Для электронной микроскопии клетки S.aureus фиксировали в 2,5%-ном растворе глютарового альдегида в течение 30 мин и в 1%-ном растворе осмиевой кислоты в течение 15 мин. Затем по общепринятой методике заключали в смолу эпонаральдит. Оценивали следующие структурные изменения в микробной клетке: незначительные изменения в виде вакуолизации цитоплазмы; утолщение клеточной стенки; нарушение процесса деления клеток (формирование цепочек);
образование гигантских клеток (несбалансированный рост);
образование клеток фестончатой формы с истонченной клеточной стенкой и разрушенной мембраной;
пикноз цитоплазмы;
деспирализация ДНК и вакуолизация нуклеоида;
лизис клеток. Рассчитывали частоту развития указанных изменений в процентах по отношению к 100 учитываемым клеткам S.aureus. Соединение Ia вызывало глубокие структурные изменения в бактериальной клетке. Как видно из табл. 9, у 50-60% клеток имела место деспирализация ДНК с частичной фрагментацией и распадом вещества нуклеоида, у 30-40% клеток развивалось утолщение клеточной стенки, в 20-25% случаях формировались цепочки неразъединенных клеток, в 30-45% случаев наблюдались клетки фестончатой формы с утонченной клеточной стенкой и разрушенной мембраной, в 30-40% встречались гигантские клетки, при воздействии максимальной концентрации в 30% случаев отмечен полный лизис клеток, под действием этильного аналога лизис клеток не обнаружен. Фестончатые клетки, клетки с несбалансированным ростом (гигантские), лизис клеток - все это свидетельствует о грубых необратимых изменениях в клетках S. aureus под действием соединения Ia. Этот процесс в значительно меньшей степени выражен при воздействии на клетку в тех же условиях опыта этильным аналогом или оксолиниевой кислотой. Деспирализация ДНК под действием соединения Ia наблюдается у 50 обследованных клеток (действующая доза 5 мкг/мл), под действием препаратов сравнения в этой же дозе - в 20-30% случаев (см. табл. 9). Соединение Ia малотоксично: ЛД₅₀ соединения Ia для белых мышей при введении per os 2100 мг/кг (1858-2373), при введении парентерально (внутрибрюшинно) так же в опытах на мышах 580 мг/кг (517,8-649,6). Соединение Ia хорошо переносится в дозах до 500 мг/кг под кожу и per os инфицированными белыми беспородными мышами массой 15-16 г. Таким образом, проведенные исследования показывают высокую антибактериальную активность соединения Ia в опытах in vitro (на различных моделях) и в опытах на инфицированных животных. Эксперименты показывают также существенное превосходство соединения Ia в активности по сравнению со структурным аналогом. Наиболее важным свойством соединения Ia является его активность на двух экспериментальных моделях в отношении инфекции, вызванной синегнойной палочкой (Ps. aeruginosa) как при введении под кожу, так и при введении per os. Эффективность соединения Ia на модели гнойного менингита мышей даже в условиях однократного введения вещества per os говорит о способности соединения Ia проникать через гематоэнцефалический барьер, что является необходимым свойством для препаратов, рекомендующихся для лечения гнойных менингитов и менингоэнцефалитов. Очень важно, что соединение Ia малотоксично как при введении per os (ЛД₅₀ 2100 мг/кг), так и парентерально (внутрибрюшинно, ЛД₅₀ 580 мг/кг). Соединение Ia является высокоактивным ингибитором синтеза ДНК бактерий, существенно превышая активность этильного аналога и оксолиниевой кислоты, что показывает перспективность поисковых исследований в ряду 6-нитропроизводных 4-хинолон-3-карбоновой кислоты.

Формула изобретения

ГИДРОХЛОРИД 1-ЦИКЛОПРОПИЛ-6-НИТРО-7-(4-МЕТИЛПИПЕРАЗИНИЛ)-4-ОКСО-1,4-ДИГИДРОХИНОЛИН-3-КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ. Гидрохлорид 1- циклопропил -6- нитро -7-4- метилпиперазинил -4- оксо- 1,4- дигидрохинолин -3- карбоновой кислоты формулы

обладающий антибактериальной активностью.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5