Способ определения адреналина в биологическом материале

 

Изобретение относится к физико-химическим методам анализа и может быть использовано в фармакологии. Цель - ускорение способа при одновременном повышении ее точности. В электродный сосуд помещают боратный буфер PH 7, 6, ферментный препарат с моноаминооксидазой и раствор адреналина, добавляют хлористый калий, инкубируют в присутствии биокатализатора с моноаминооксидазной активностью при PH, большем или равном 12, до полного дезаминирования адреналина. Потенциометрически определяют метиламин - продукт превращения адреналина. Продолжительность способа сокращается в 2 - 3 раза, а ошибка метода уменьшается на 8,5%.

СООЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИи1ИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (S>)S О 01 Н 33/74

ВЖ0@З" пиеятио TEXHN%egal

Р, 1 Д11ОТЕКА

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР (21) 4332044/28-14 (22) 19.10;87 (46) 07.05.90. Бюл. Ф 17 (71) Латвийский государственный университет им. П. Стучки и Институт эволюционной физиологии и биохимии им. В.М. Сеченова AH СССР (72) В,А. Гринберг, Е.Б. Никольская, О.В. Ягодина, A.À. Прикулис и lI Ю. Балцере (53) 612.016 (088.8) (56) Bohuol С. Biological active

amines. Clinical Biochemistry, Berlin — New — Jork, 1974, р . 855870. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДРЕНАЛИНА В

БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

Изобретение относится к области физико-химических методов анализа, в частности к потенциометрическому определению микроколичеств адреналина в биологическом материале, и может быть использовано в фармакологии.

Цель изобретения — ускорение способа при одновременном повышении ее точности, Способ осуществляется следующим образом, В электродный сосуд помещают борат=ный буфер рН 7,6. Затем туда же добавляют ферментный препарат с моноаминоксидазной (MAO) активностью и раствор адреналина ° Пропускают над реакционной смесью кислород, затем плотно закрывают сосуд и инкубируют смесь при 37 С, Вынимают иммобилизованный

„„SU„„1562858 А1

2 (57) Изобретение относится к физикохимическим методам анализа и может быть использовано в фармакологии.

Цель — ускорение способа при одновременном повышении ее точности. В электродный сосуд помещают обратный буфер рН 7,6, ферментный препарат с моноаминооксидазой и раствор адреналина, добавляют хлористый калий, инкубируют в присутствии биокатализатора с моноаминоаксидазной активностью при рН, большем или равном 12, до полного дезаминирования адреналина. Потенциометрически определяют метиламин— продукт превращения адреналина. Продолжительность способа сокращается в

2-3 раза, а ошибка метода уменьшается на 8,5Е. препарат из реакционной среды, добавляют хлорид калия до насыщения, закрывают сосуд пробкой с вмонтированным в нее рН-электродом с каплей тритона Х-305. Снова пропускают над реакционной смесью кислород, а затем через капилляр вводят раствор гидроксида натрия до рН 12 и выше для полного выделения метиламинч. После vcтанов— ления постоянного потенциала регистрируют показания рН-метра и по градуировочной прямой определяют концентрацию адреналина. Чувствительность способа составляет 5 ° 10 м.

В основе предлагаемого способа лежит реакция дез аминиров алия адреналина под воздействием биоспецпфического катализатора с монсампноксидаз1562858 ной активностью (МАО), полученного из митохондрий:

0Н

НО i i СН вЂ” CH NHCH +Н O

NAO — 2 3 но )-сн — сно+ын сн н р

0Н

Образующийся при дезаминировании метиламин в присутствии насыщенного !

5 раствора хлорида калия можно вытеснить из реакционной среди и, таким образом, определить его количество по тенцио ме трич е с ки. Гр адуиров очная прямая в координатах Е (потенциал) отрицательный логарифм концентрации адреналина, полученная при полном дезаминировании адреналина показывает, что область линейной электродной функции достигает 5 О 6 моль/л.

Пример 1. Анализ содержания адреналина в. экстракте сердца морской свинки, Способ реализуют в устройстве для определения моноаминов. В.электрод30 ный сосуд помещают 1 мл 0,1 M боратного буфера рН 7,6, 2 мл экстракта и

1 мл дистиллированной воды. Затем добавляют 0,06 r ферментного препарата с МАО активностью и пропускают над реакционной смесью кислород в

35 теч ение 5-1 О мин. Плотно закрыв ают сосуд и инкубируют смесь при 37 C в течение 60 мин. Далее вынимают ферментный препарат из реакционной сре40 ды, добавляют туда 1,2 г хлорида калия, закрывают сосуд пробкой с вмонтированным в нее рН-электродом с каплей

Тритона Х-305. Снова пропускают над реакционной смесью кислород в течение 5-10 мин, а затем через капилляр вводят раствор гидроокиси натрия 5 М до рН 12 для полного выделения метиламина. После установления постоянного потенциала (30 мин) регистрируют показания рН-метра и по градуировочной прямой определяют концентрацию адреналина,,равную 5 10 моль/л.

Пример 2„ Анализ содержания адреналина в моче кошки.

Предварительно выделяют из пробы мочи катехоламины (КА) путем адсорбции на окиси алюминия в щелочной среде. Адсорбированные норадреналин и дофамин легко окисляются кислородом, особенно в присутствии тяжелых металлов, что позволяет отдельно определить адреналин, так как адреналин окисляется только при pEI 3. Приготовленный таким образом элемент используют для определения адреналина. В электродный сосуд помещают 1 мл боратного буфера рН 7,6 и 1 мл элюента, добавляют 2 мл дистиллированной воды.

Затем туда же добавляют 0,06 r ферментного препарата с МАО активностью.

Далее проводят операции аналогично . примеру 1. По градуировочной прямой определяют концентрацию адреналина, равную 5 10 М.

Пример- 3. В электродный сосуд помещают 2 мл 0,1 М боратного буфера с pEI 7,6, добавляют 1,8 мл дистиллированной воды. Затем туда же добавляют 0,06 г оиокатализатора с МАО активностью и 0,2 мл раствора адреналина О,!Е (т.е, 2,5 10 4 моль/л).

Далее проводят инкубацию аналогично как в примере 1. Пссле инкубации добавляют 1,2 r хлорида калия, пропускают кислород, а затем вводят раствор гидроокиси натрия до установления рН

l2 0. Через 30 мин после полного выделения метиламина и установления постоянного потенциала регистрируют показания рН-метра и пс градуировочной прямой определяют концентрацию адреналина, равную 2,5 !О 4 моль/л.

Пример 4, В электродный сосуд помещают 2 мл 0,1 М боратного буфера рН 7,6, добавляют 1,8 мл дистиллированной воды, 0,06 r биокатализатора с МАО активностью и 0,2 мл раствора адреналина 0,17. (из ампулы). Далее проводят анализ аналогично примеру 1,. за исключением установления рн среды при выделении метиламина„ равным

12,5.

По градуировочной прямой определяют концентрацию адреналина, равную

2,52 10 моль/л. Таким образом, рН вЂ” 4 среды 12,5 обеспечивает полное выделение образовавшегося метиламина.

Предлагаемый способ обладает следующими преимуществами по сравнению с известным: продолжительность определения адреналина составляет 2-2,5 ч, в известном 5-6 ч, высокая точность определения ошибка метода составляет 1,5Е, по известному способу.

5 !562858

Формула изобретения

Составитель Н. Гуляева

Редактор Л. Гратилло Техред М.яндык

Корректор Л. Бескид а

Заказ 1062 Тираж 510 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35,. Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

Способ определения адреналина в биологическом материале, включающий обработку исследуемой пробы с последу5 ющим определением продукта превращения адреналина и расчетом eFo калиб" ровочной кривой, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью ускорения способа при одновременном повышении

6 точности, к анализируемой пробе до" бавляют хлористый калий до насыщения, инкубируют в присутствии биокатализатора с моноаминоксидазной активностью при рН, большем или равном !2, до полного дезаминирования адреналина, а в качестве продукта превращения адреналина определяют метиламин, содержание которого регистрируют потенциометрически.