Способ получения пептидов

 

Изобретение касается пептидов, в частности получения пентида общей ф-лы R-A-S-CH<SB POS="POST">2</SB>-CH(CH<SB POS="POST">3</SB>)-C(O)-R<SB POS="POST">1</SB>, где R=H, бензоил, циклопентакарбонил, трет-бутилоксикарбонил, ацетил

A-D-аланил, D-лейцил

D -и L-фенилаланил

R<SB POS="POST">1</SB>-L-пролил которые проявляют противогипертоническую активность, что может быть использовано в медицине. Цель - создание новых активных и малотоксичных пептидов. Последние получают реакцией соединений ф-л II и III H-S-CH<SB POS="POST">2</SB>-CH(CH<SB POS="POST">3</SB>)-C(O)-R<SB POS="POST">1</SB> (II) и R-A-H (III). Новые вещества по действию сравнимы с каптоприлом, но более устойчивы к гидролизу в биологических и других средах (6 ч против 30 мин), а при использовании N-[3-(N-циклопентанкарбонил-D-аланилтио-2-D-метилпропаноил)]-L-пролила - более длительны по действию (его доза 40 мг/кг против 100 мг/кг). 4 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

1191 (И) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К flATEHTY

1 1

Ф с: (КК (1)j (1 (2))

ГКК (3)1

PRi (4)1 метанол:хлороформ, 1:1 об.ч.; бензол. вода:бутанол, 9:1:9 об. ч; уксусная кислота:вода:н-бутанол, 26:24:150 об.ч.; н-бутанол. пиридин:уксусная кислота: вода, 15:10:3:

:12 об.ч., н-бутанол:уксусная кислота:этилацетат:вода, 1:1:1:

:1 об.ч.; система 1 система 2 система 3 система 4 система ; (Ri (5)) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4015500/23-04 (62) 3263400/23-04 (22) 28.01.86. (23) 09.03.81 (31) 128953; 158278 (32) 10.03.80; 10.06.80 (33) US (46) 23.05.90. Бюл. У 19 (71) Дзе Юниверсити оф Майами (118) (72) Джеймс Вальтер Райан и Альфрэд Чанг (US) (53) 547.964.4.07(088.8) (56) Шредер Э., Любке К. Пептиды.

М.: Мир, 1967, с. 116. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИ, 10В (57) Изобретение касается пептидов, в частности получения пептида общей ф-лы R-А-S-СН -СН (СНэ ) — С (О) -11 (, 1) Изобретение относится к способу получения производных пептидов — новых биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине.

Цель изобретения — способ получения новых производных пепти (ов — мало(5))5 С 07 К 5/06, А 61 К 37/02

2 где К-Н, бензоил, циклопентакарбонкл,. трет-бутилоксикарбонил, ацетил; AD-аланил, D-лейцнл, П- и 1.-фенилаланил;

R< — L-пролил, которые проявляют противогипертоническую активность, что может быть использовано в медицине.

Цель — создание новых активных и малотоксичных пептидов. Последние получают реакцией соединений ф-л

Н S-СН СН(СНЭ) 0(())-К4 и R А-Н

1)

Новые вещества по действию сравнимы с каптоприлом, но более устойчивы к гидролизу в биологических и других средах (6 ч против 30 мин), а при использовании N-(3-(N-циклопентанкарбонил-D-аланилтио-2-D-метилпропаноил) -L-пролила — более длительны по действию (его доза 40 мг/кг против

100 мг/кг) . 4 табл. токсичных, высокоактивных в отноаении противогипертонической активности соединений, устойчивых к гидролиэу в биологических средах.

Системы растворителей, используемые при хроматографировании в тонком слое силикагеля ° . система 6 (Rf (6)) система 7 PRf (7)) система 8 (Rf (8)) 1567125 4

- хлороАорм:метинол:уксусная кислота, 2:1:0,003 об.ч.; н-бутанол:уксусная кислота:вода, 4:1:1 об.ч.; этилацетат:уксусная кислота, 38:2 об.ч.

ЯМР-спектральные данные получены на приборе ЬО МГц.

Все соединения получены по методике, аналогичной описанной для И-(3- tp (N-бензоил-L-фенилаланилтио)-2-D-метилпропаноил1-1.-пролина.

К раствору 675 мг N áåíçîèë-1.-фе.о нилаланина в 5 мл ДМФА при -15 С добавляют 406 мг N, N-карбонилдиими- 15 дазола в 5 мл ДМФА и результирующий о. раствор перемешивают при -10 С в течение 1 ч, затем добавляют 543 мг

N-(3-меркапто-2-1)-метилпропаноил)-Lпролина и 0,35 мл триэтиламина и пе- 20 ремешивают 1О мин при той же температуре и еще 50 мин при комнатной температуре.

Растворитель отгоняют при понижено, ном давлении при 30 С и к остатку 25 добавляют 20 мл воды и 20 мл бензола.

Смесь доводят до рН 2 добавлением

4н. раствора НС1 при перемешивании и охлаждении на ледяной ванне.

Органический слой дважды промыва- 3р ют насыщенным раствором ИаС1 и органический растворитель удаляют отгонкой на центробежном испарителе после осушения над безводным М8804.

Остаток очищают хроматографией в колонке на SiO (2 см х 45 см) и элюируют смесью СНС1 и МеОН (0,5-2Х

МеОН в СНС1э).

Пиковые фракции собирают воедино

H pBCTBOpHTeJIh ОТГОНЯЮТ при пОНижеН 40 ном давлении с получением 705 5 мг (60,3Х) И-(3-(N-бензоил-1;фенилаланилтио)-2-1>-метилпропаноил -L-пролина в виде масла.

Физико-химиче с к ие харак те ристики 45 полученных соединений.

N-(3-(N-циклопентакарбонил-П аланилтио)-2-11-метилпропаноил;-L-пролин " выход 49,0%; (М}д=-47,2; Rf (6)=0,62;

Rf (7)=0,74.

8 (в CDCI +CD OD): 1,20 (3H, м.д., СН ); 1,38 (ÇH, д., СНз); 1,52,4 (12Н, м., СН ); 2,4-3,2 (4Н, м., СН и СН ), 3,3-3,8 (2Н, м., СН ) и

4,2-4,8 (2Н, м., СН).

N-(3-(N-трет-бутилоксикарбонил-1)аланилтио)-2-D-метилпроианоил)-1.-пролин — выход 82,0 ; (c() = -62,5; Rf (6)=

0,59; Rf (7) = 0,73.

N-(3-(N-ацетил-1)-лейцилтио)-2-Dметилпропаноил -L-пролин — выход

56,0Х; (Ы) =-29,5; 1И (b)=0,55; Кй (7)=0,59 °

N-(D-аланилтио-2-11-метилпропаноил)L-пролин — выход 92,0Ы; (0 ) =-79,9;

Rf (6)=0,37; 1М (7)=0,49;

N -t 3-(N — М-бензоил — 2-Аенилаланнлтио)-2-D-метилпропаноил)-1. — ïðîëèí— мол.вес 468; () =-116,8; выход 60,3i.;

Rf (1)=0,52; Rf (2)=0,70; Rf (3)=

=0,56; Кй (4) = 0,61; Rf (5) = 0,75;

Rf (6) = 0,56; Рf (7) = 0,74.

SIMP F (в С1) С1 =СDqOD): 1,19 (ЗН, б.д., CHg); 1,5-2,4 (4Н, м., СН );

2,5-3,3 (5H, м., CH и СН ); 3,3-3,8 (2Н, м., СН ); 4,0-4,4 (1H, м., СН);

4,8-5,2 (1Н, м., H); 7,23 (5H, с °, ароматич. Н); 7,2-7,9 (5H, м., ароматич. Н).

-7

J — З,чх10

N- 13- (N-бензоил-D-Аенилаланилтио)2-1>-метилпропаноил -Tг-пролин — выход 55,6 ; (e) =-25,1; 1И (6)=0,56;

Rf (7)=0,7 .

Проведены биологические испытания соединений, полученных в условиях предлагаемого способа.

Определена противогипертоническая активность предлагаемых соединений и известного — каптоприла.

Значение Л 0 — концентрация

501-ной ингибиторной активности на ангиотензин превращающий Аермент.

Система анализа. 1 мл инкубационной смеси, состоящей из 0,6 мл боратного буфера, 0,2 мл 17,5 мМ бензоилГли-Гис-JleH боратного буАера, смешивают боратный буАер и раствор Аермено, та, инкубируют при 37 C в течение

60 мин.

Боратный буАер: 0,1 М борная кислота, содержащая 0,8 М БаС1 и 0,1 M

На СО, содержащий 0,8 М Ма 1, смешивают и рН доводгт до 8,3.

АСЕ - сухой ацетоновый экстракт кроличьего легкого.

Измерение — Уо поглощение при

228 нм после экстракции бензоил-Гли этилацетатом.

В табл, 1 приведен средний процент ингибирования вызванной гипертонии

15671 в результате использования дозировок в 0,4 ммоль/кг каждого иэ перечисленных соединений.

Из данных табл. 1 видно, что несмотря на то, что эффективность пред5 лагаемых соединений меняется в зависимости от времени и от конкретного применяемого лекарства, тем не менее действие этих соединений сопоставимо с действием каптоприла в выбранных дозировочных концентрациях.

При таких высоких концентрациях применение каптоприла приводит к достаточно высокому уровню возможных побочных эффектов у человека, что вынудило использовать гораздо меньшие дозировки в реальных клинических условиях лечения человека. Кроме того, по уровню длительности действия пер- 20 вое из укаэанных в табл. 1 соединений превосходит каптоприл.

Предлагаемые соединения по сравнению с каптоприлом значительно более устойчивы как в биологической, так и в других средах. Об этом свидетельствует их устойчивость к непосредственному гидролизу в сильно гидролизующей среде, а также сравнительно долгое время хранения, которое они про-.. являют. Данные испытаний in vitro представленные ниже, показывают присущую многим из этих соединений устойчивость в разрушающей среде плазмы и гомогенатов тканей.

А. Инкубируемая смесь: 1 мл

10%-ного гомогената печени крысы (0,1 M буфера фосфата калия, рН 7,4) плюс 1 мл испытуемого соединения (2x10 М в том же буферном растворе фосфата). Метод испытания: из инкубируемой смеси отбирают 100 мкл, депротонизируют добавлением 200 мкл этанола и центрифугируют. 20 мкл центрифугата подвергают ВЭЖХ (высоко45 эффективной жидкостной хроматографии).

В. Инкубируемая смесь: 1 мл 5%-ного гомогената печени крысы (0 1 N буфера фосфата калия, рН 7,4) плюс 5Q

1 мл раствора испытуемого соединения (2х10 М в том же буферном растворе фосфата). Метод испытания: из инкубируемой среды отбирают 100 мкл, после чего добавляют 6 капель 1 и НС1 и 5 мл этилацетата. После механического перемешивания в течение 10 мин и 10 мин центрифугирования отобранный слой этилацетата испаряют. Оста25

6 ток растворяют в 1 мл воды и затем

0,5 мл 0,43 If фосфатного буфера (рН

6,85) и 5 мкл 5х10 М blfcIf 111 — (и-(2бензимидачолил)фенид1малеHHHjl} и ос о тавляют на 40 мин при 0 С. Определения проводят при поглощении 310 нм и эмиссии 365 нм (предел иэмерения

0,14 г каптоприла).

С, 0,154 М фосфатный буфер 1,5 мл

2% центрифугата, 105000х 0,5 мл

10 мМ испытуемого соединения 0,1 мл

Всего: 2, 1 мл

37 С; 0, 30, 60, 120, 180

100 мкл инкубируемой смеси

200 мкл метанола

Встряхивание и центрифугирование

10 мкл центрифугата

ВЭЖХ (колонка Бонданак С18, смесь растворителей СН СЫ вЂ” 0,1% тетраметиламмонийгидроксид, детектирование

220 нм, скорость потока 1 мл/мин).

D. Инкубируемая смесь: 1 мл плазмы крови крысы (0,1 M буфера фосфата калия, рН 7,4) плюс 1 мл раствора испытуемого соединения (400 мкг/мл в том же буфере). Метод испытания. из реакционной смеси отбирают 100 мкл, депротонизируют добавлением 200 мкл

EI0H и центрифугируют, 20 мкл центрифугата подвергают ВЭЖХ.

Е. Икубируемая смесь: 1 мл 20%-ного гомогената кишечника крысы (0,1 М буфера фосфата калия, рН 7,4) плюс

1 мл раствора испытуемого соединения (400 мкг/мл в том же Gyhepe). Метод испытания: из реакционной смеси отбирают 100 мкл, депротонизируют добавлением 20 мкл EIOH и центрифугируют.

20 мкл центрифугата подвергают ВЭЖХ.

F. Инкубируемая смесь: 1 мл

20%-ного гомогената печени крысы (0,1 М буфера фосфата калия, рН 7,4) плюс 1 мл раствора испытуемого соединения (400 мкг/мл в том же буфере) .

Метод испытания: из реакционной смеси отбирают 100 мкл, депротонизируют добавлением 200 мкл EIOH и центрифугируют. 20 мкл центрифугата подвергают ВЭЖХ. Данные приведены в табл.2.

Присущая этим соединениям устойчивость подтверждена данными испытаний

in vivo, показывающими, что в большинстве случаев значительный процент исходного соединения остается на мно1567125

30

По меньшей мере одно из предлагаемых соединений а именно Х- ГЗ(И-цик55 лопентилкарбонил-3)-аланилтио)-2-Dметилпропаноил) -1.-пролин (срс-D-а1а-SO), показал неуменьшающуюся эффективность в течение от 90 до 180 мин гие минуты в кровеносной системе крыс после его введения. Эти данные для двух соединений приводятся ниже.

Внутривенное введение.

36 мг N — (3-(N — бензоил-1.-фенилаланилтио)-2-D-метилпропаноил)-L-пролина (В -L-Phe-SO) и N- (3-(N-бензоил1

1)-фенилаланилтио)-?-1>-метилпропаноил)-L-пролина (В>-D-Phe-SO) в 0,5 мл

0,1 М раствора 11аНСО вводят внутривенно двум крысам линии 5D. Вес каждой крысы 360 г, перед инъекцией крыс связывают на 21 ч. С помощью жидкостной хроматографии определяют концентрацию в плазме введенного соединения и продуктов его гидролиза: бензоил-1)-Аенилаланина (В -D-Phe) и бензоил-1-фенилаланина (В -L-Phe).

Данные приведены в табл. 3.

Пероральное введение. Связанным на ночь крысам весом 350 г вводят перорально 100 мг на 1 кг массы тела

N- ГЗ-(бензоил-1.-фенилаланилтио)-2-Dметилпропаноил)-1-пролина. Испытуе- 25 мый раствор содержит 20 мг N- P-(бензоил-L-фенилаланилтио)-2-1)-метилпропаноил)-1-пролина в iX-ном водном растворе гумиарабика. Концентрацию

N- (3-(бензоил-1-фенилаланилтио)-2-Dметилпропаноил -L-npozmva и продукта его гидролиза (бензоил-L-фенилаланина) определяют в плазме крови, отбираемой из воротной вены, и в потоке желчи с помощью жидкостной хроматографии. Данные приведены в табл.4.

Известно, что каптоприл напротив быстро разрушается с образованием дисульфида и других продуктов метаболизма, каждый из которых неактивен 40 в качестве ингибитора.

Через 60 мин инкубирования с плазмой крови крыс, человека, обезьян и собак S-каптоприл, оставшийся без изменения, составляет соответственно 45

О, 7, 10 и 25И, а основным продуктом разложения является дисульфид.

Продукт центрифугирования при

9000xg гомогената печени, почек и кишечника крыс представляет собой через

120 мин продукт почти полного превращения каптоприла в его дисульфид и другие соединения ° после перорального введения. Данные, подтверждающие это, приведены в табл.1. Показано, что каптоприл до» стигает пиковой эффективности при

90 мин, после чего следует падение эффективности. Ио истечении 180 мин

N- (3-(N-циклопентилкарбонил-D-аланилтио)-2-D-метилпропаноил)-I.-пролин остается более эффективным ингибитором без всяких признаков того, что его действие ослабевает.

Сравнительные испытания показали, что действие на нормального человека

40 мг (0,096 ммоль) N- (3-(N-циклогексиллкарбонил-D-аланилтио)-2-D-метилпропаноил)-L-пролина более длительно по сравнению со 100 мг (0,46 ммоль) каптоприла. Эти результаты дают подтверждение тому, что сложные тиозфир. ные производные каптоприла с ациламинокислотами обладают улучшенным действием по сравнению с самим каптоприлом.

Предлагаемые соединения обладают большой химической устойчивостью.

Кап1оприл имеет необычайно короткий срок хранения, период полураспада его в водных растворах составляет примерно 30 мин. Сухой пороыок разлагается более чем на 50 .при выдерживании

3 недели при HS С.

Предлагемые соединения, не имея свободной меркаптогруппы, сами по себе устойчивы. Их растворы могут храниться в течение длительного периода времени, так раствор N-(3-(N-бензоилD-фенилаланилтио)-2-D-метилпропаноил)-L-пролина в смеси метанола с водой (1:1) в концентрации 1 мг/мл не проявляет никаких признаков разложения спустя 6 ч хранения. Кроме того, эти соединения не требуют подмешивания восстановителя к их поронкообразным AopMRM с целью избежать их димеризации, характерной для каптоприла. ормулаизобретения

Способ получения пептидов общей формулы

О з- A-8- evq- сн-с

I R1 он где К вЂ” водород,.бензоил, циклопентакарбонил, трет-бутилоксикарбонил, «цетил;

1567125

А — D-аланил, 1)-лейцил, D- u Lфенилаланил;

К - L-пролил, отличающийся тем, что осуществляют взаимодействие соединений общей формулы

О нз-он - -

R1

Н3

1О

Таблица!

Соединени активность при времени действия, мин

20 180

35

42

12

26

12

31 34 21

14 28 35 41 36 31 26

12 23 46 56 58 48 37

Таблица2

Соединение етод инкуирования

N- (3-(N-Циклопентакар- 96 бонил-D-аланилтио)-2D-метилпропаноил) -I.пролин

95 93

96 95 92

N- (3-(N-Ьутилоксикарбонил-1>-аланилтио)2-D-метилпропаноил)L-пролин 97

N- (3-(N-Ацетил-D-лейцилтио)-?-13метилпро- 99 паноил) -L-пролин 105,1

N-(D-Аланилтио-2-Dметилпропаноил)-1.пролин

96 94

98 94

99,6

92,1

86 65

N- (3-(N-Циклопентанкарбонил-D-аланилтио)2-D-метилпропаноил L-пролин

N- (3(М-трет-Бутоксикарбонил-1)-аланилтио)2-D-метилпропаноил)L-пролин

N-(3-(N-Ацетил-D-лейцилтио)-2-И-метилпропаноил) -I.-пролин

N-(D-Аланилтио-2-Dметилпропаноил)-1.-пролин

Каптоприл с соединением общей формулы

R-А-Н, где R,R и Л имеют указанные значения.

Приоритет по признакам

10.03.80 при К вЂ” ацетил, А - D-, L-фенилалаиил, D-аланил;

10 ° 06.80 при К вЂ” водород, бензоил, циклопентакарбонил; А — D-лейцил.

1567125

Та блица 3

Соед

25 35 60

Т а б л и ц а 4 лазме, ммоль/мл, 20

N- (3-(Бензоил-?.-фенилаланилтио)-2-Б-метилпропаноил)-Lпролин

Бензоил-I. ôåíèëàëàíèí

И- (3-(Бензоил-L-фенилаланилтио)-2-0-метилпропаноил -Lпролин

Бе н з о ил-I.-Ae avx av vv

Воротная вена

0,025

0,247

0,010

0,312

0,002

0,054

Желчь

0,677

0,786

0,493

О, 300

0,102

0,164

Редактор И,Пмакова

Подписное

Тираж 318

Заказ 1231

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

11 11

Производственно-издательский комбинат Патент . г.ужгород, у». l агарина,101

N- (3-(Бензоил-1; фенилаланилтио)2-D-метилпропаноил1-L-пролин

В -L-Phe

N- (3-(Бензоил-Dфенилаланилтио)—

2-1)-метилпропаноил) -L-пр олин

L -D — Р? е

581 423 243 149 119 98 33

14 36 79 91 105 96 143 119 127 (n=1) 492 334 227 171 135 117 22 35 1

15 33 57 76 86 100 111 112 120 (n=1) Составитель В.Волкова

Техред П.Сердюкова КоРР« пР 0 Кра" и""а