Способ определения циметидина или ранитидина в плазме крови

 

Изобретение относится к медицине, конкретно к хроматографическому анализу экзогенных веществ в биологических жидкостях, и может быть использовано для определения H<SB POS="POST">2</SB>-гистаминоблокаторов циметидина или ранитидина в плазме крови. Способ заключается в том, что PH плазмы доводят до 8,2 - 8,7 сухим карбонатом натрия, экстрагируют плазму хлороформом и разделяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с силикагелем с обращенной фазой. В качестве подвижной фазы используют смесь ацетонитрила с 5%-ным водным раствором хлорида калия на 0,1%-ной уксусной кислоте в объемном соотношении 8:92. Определение циметидина и ранитидина проводят спектрофотометрически при длинах волн 218 - 222 и 222 - 228 нм соответственно. Способ обеспечивает повышение точности за счет снижения коэффициента вариации почти в 2 раза. 8 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУ БЛИН

А1 (51)5 G 01 N 33/48 33/52

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4406387/28-14 (22) 06.04.88 (46) 15.06.90. Бюл. и 22 (71) 1-й Московский медицинский институт им, И.М. Сеченова (72) В,И. Волченок, Е.В. Селина, В.Г. Кукес, С.М. Давыдов и Б.К. Зарипова (53) 612 ° 015(088.8) (56) Fleitman .1., Torosian G., Perrin J Í. — J. СЬготчасо8гар11у, 1982, v. 229, р. 255. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИМЕТИДИНА

ИЛИ РАНИТИДИНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ (57) Изобретение относится к медицине, а именно к хроматографическому анализу экзогенных веществ в биологических жидкостях, и может быть использовано для огределения Н<-гистаИзобретение относится к медицине, а именно к хроматографическому анализу, и может быть использовано для анализа экзогенных веществ Н -гистаминоблокаторов циметидина и ранитидина в биологических жидкостях, Цель изобретения — повышение точности способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Для анализа берут 1 мл плазмы, содержащей циметидин или раннтидин, добавляют 100-150 мг сухого карбоната натрия или 0,5 мл 0 001 М ХаОН для создания рН в диапазоне 8,2-8,7 и

15 мл хлороформа. После 10-минутного встряхивания водную и органическую фазы разделяют центрифугированием, водную фазу удаляют, а органическую

„„Я0„„1571503

2 миноблокаторов циметидина или ранитидина в плазме крови. Способ заключается в том, что рН плазмы доводят до 8,2-8,7 сухим карбонатом натрия, экстрагируют плазму хлороформом и разделяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с силикагелем с обращенной фазой. В качестве подвижной фазы используют смесь ацетонитрила с 53-ным водным раствором хлорида калия на 0,1ь-нои укс счои кислоте в объемном соотношении 8:92. Определение циметидина и ранитидина проводят спектрофотометрически при длинах волн 218-222 и 222-228 нм соответственно. Способ обеспечивает повышение точности за счет снижения коэффициента вариации почти в 2 раза. 8 табл. упаривают досуха при 40 С с помощью роторного испарителя. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл подвижной фазы и наносят аликвоту (0,05 мл) на <олонку. Разделение осуществляется на колонке, заполненной силикагелем с (ими обращенной фазой (С ), с помощью сме- ©Д си ацетонитрил — 50 КС1 .+ 0,13 CFI COOH (,",;) в воде в соотношении 8:92 (по объему). фф

Количественное определение концентра" ций осуществляют с помощью спектрофотометрического детектора. Детектирование проводят при длинах волн, соответствующих максимальному поглоще Ь нию: 218-222 нм для циметидина и 222225 нм для ранитидина. Количественное определение циметидина и ранитидина осуществляют методом калибровки. Калибровочные зависимости линейны в

1571503 диапазоне концентраций 0,1-20 мкг/мл ,для циметидина и 0,05-2,5 мкг/мл для ранитидина. Оба указанных диапазона концентраций шире диапазонов концент-, раций циметидина и ранитидина, наблюдаемых в плазме крови больных при любом способе назначения препарата.

Минимальные обнаруживаемые с помощью предлагаемого способа концентра-! ..., Ции циметидина и ранитидина составляisoò 50 и 20 нг/мл соответственно. Спо соб достаточно прост, надежен и экономичен вследствие использования легкодоступных (в том числе отечествен ных) реактивов, позволяет без замены подвижной фазы и последующей длитель= ной стабилизации колонки определять циметидин и ранитидин в плазме кро,ви, что дает дополнительный экономи- 20 .ческий эффект.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, Пример 1. Больной С., 37 лет, .поступил в 0-е терапевтическое отде- 25 ление 23 ГКБ с диагнозом - язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки.

Иейтронорм (циметидин фирмы "Ebewe", Австрия) назначали внутривенно в дозе 200 мг В 5 мл 0 9 Ф НОГО раствора 0 хлористого натрия. Забор крови проводили из локтевой вены другой руки чере:-; катетер до и через 5, 10, 15, 30 мин, 1, .2, 4, 5, 6 ч после приема циметидина. Кровь центрифугировали при 3000 об/мин. Плазму отбирали и хранили при -20 С. К 1 мл плазмы добавляли 100 мг сухого карбоната натрия для создания рН = 8,2 и 15 мл хлороформа. После 10-минутного встря- 40 хивания водную и органическую фазы разделяли центрифугированием (5 мин при 000 об/мин), водную фазу удаляли, а органическую упаривали при

40 С досуха с помощью роторного исдарителя Rotavapor -R-110 (Фирмы—

"Buchi", ФРГ). Сухой оста-ок растворяли в 0,5 мл подвижной фазы, as.èêâîту (0,05 мл) наносили на колонку.

Определение циметидина проводили на жидкостном хроматографе "А1аех"

110 А (СЫА) с инжектором на 0,05 мл и колонкой (250х4,6 мм) с неподвижной фазой Spherisorb ODS 5 мкм. Подвижной

Фазой служила смесь ацетонитрил5ж КС1 + 0р13 СнэСООН В ВОДе В CQOTношении 8:92 (по объему), скорость элюирования 1,5 мл/мин. Детектирование проводили с помощью спектрофотометра "Hitachi" 100-40 на длине вогны

218 нм. Результаты приведены в табл.!.

П р и и е р 2. Больной С., поступил в 10-е терапевтическое отделение

23 ГКБ с диагнозом - язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки, Нейтронорм (циметидин фирмы "ЕЬеюе", АВстрия) назначали внутривенно в дозе 200 мг в 5 мл О,gl-ного хлористого натрия, Забор крови проводили из локтевой вены другой руки через катетер до и через 5, 10, 15, 30 мин, 1, 2, 4, 5, 6 ч после приема циметидина. Кровь центрифугировали при 3000 об/мин. о

Плазму отбирали и хранили при -20 С.

К 1 мл плазмы добавляли 0,5 мл

0,001 М NaOH для создания рН 8,7 и 15 мл хлороформа. После 10-минутного встряхивания водную и органическую фазы разделяли центрифугированием (5 мин при 3000 об/мин), водную фазу удаляли, а органическую упаривали при

40 С досуха с помощью роторного испарителя Rotavapor R- 110 (фирмы "Buchi" ФРГ). Сухой остаток растворяли в 0,5 мл подвижной фазы, аликвоту (0,005 мл) наносили на колонку. Определение циметидина проводили ва жидкостном хроматографе "A1tex" 110 А (СНА) с инжектором на 0,.05 мл и колонкой (250х4,6 мм) с неподвижной фазой Spherisorb ODS 5 мкм. Подвижной фазой служила смесь ацетонитрил

53 КС1 + 0,1 СН>COOH в воде в соотношении 8:g2 (по оЬъему); скорость элюирования 1,5 мл/мин. Детектирование проводили с помощью спектрофотометра "Hitachi" 100-40 на длине волны 222 нм. Результаты приведены в табл. 2.

il р и м е р 3. Больной С., 37 лет, поступил в 10-е терапевтическое отделение 23 ГКБ с диагнозом - язвенная Ьолезнь двенадцатиперстной кишки. Иейтронорм (циметидин фирмы

"Ebewe" Австрия) назначали внутривенно в дозе 200 мг в 5 мл О,Я-ного раствора хлористого натрия. Забор крови проводили из локтевой вены другой руки через катетер до и через

5, 10, 15„ 30 мин, 1, 2, 4, 5, 6 ч после приема циметидина. Кровь центрифугировали при 3000 об/мин. Плазму отбирали и хранили при †.20ОС. К

1 мл плазмы доЬавляли сухой карбонат натрия до насыщения (150 мг) для создания рН 8,5 и 15 мл хлороформа, ПоI57I503

5 сле 10-минутного встряхивания водную и органическую фазы разделяли центрифугированием (5 мин при 3000 об/мин), водную фазу удаляли, а органическую упаривали при 40 С досуха с помощью роторного испарителя Rotavapor R-11<3 (ANpfhbi "BUch1 ФРГ) . Сухой остаток растворяли в 0,5 мл подвижной фазы и аликвоту (0,05 мл) наносили на колонку. Определение циметидина,рово дили на жидкостном хроматографе

"A1tex" 110 А (CILIA) с инжектором на

0,05 мл и колонкой (250x4,6 мм) с неподвижной фазой Spherisnrb 5 мкм.

Подвижной фазой служила. смесь ацетонитрил - «1 KC1 + О,1< СНзСООН в воде

g соотношении 8:92 (по объему); скорость элюирования 1,5 мл/мин, Детектирование проводили с помощью спект- 20 рофотометра "Hitachi" 100-40 на длине волны 220 нм, Результаты приведены в табл. 3.

Пример 4. Больной П., 32 года, поступил в 11-е терапевтическое отде- д ление 23 ГКБ с диагнозом - язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки, Ракисан (ранитидин фирмы нЗдравле, Ю -ославия) назначали перорально в дозе

l50 мг. Забор крови проводили из локтевой вены через катетер до и через

15 30, 45 мин, 1, 2, 3, 5, 6, 7 ч после приема ранитидина. Кровь центрифугировали при 3000 об/мин. Плазму о отбирали и хранили при -20 С. К 1 мл плазмы добавляли 100 мг сухого карооната натрия для создания рН8,2 и

15 мл хлороформа. После 10-минутного встряхивания водную и органическую фазы разделяли центрифугированием (5 мин при 3000 об/мин ); водную фазу удаляли, а органическую упаривали при 40 С досуха с помощью роторного испарителя Rotavapor Р-110 (фирмы

ВисМ", ФРГ). Сухой остаток растворя45 ли в 0,5 мл подвижной фазы, аликвоту (0,05 мл) наносили на колонку. Определение ранитидина проводили на жидкостном хроматографе "Altex" 110 A (СНА) с инжектором на 0,05 мл и колонкой (250x4,6 мл) с неподвижной фазой Spherisorb 5 мкм. Подвижной фазой служила смесь ацетонитрил - 5ж

КС1 + 0,1> СН СООН в воде в соотношении 8:92 (по об.ьему), скорость злюиЫ рования 1,5 мл/мин. Детектирование проводили с помощью спектрофотометра "Hitachi" 100-40 на длине волны

222 нм. Результаты приведены в табл„4, 6

Пример 5. Больной П., 32 года, поступил в 11-е терапевтическое отделение 23 ГКБ с диагнозом — язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки, Ранисан (ранитидин фирмы "Здравле, 10гославия) назначали перорально в дозе

150 мг. Забор крови проводили из лак;евой вены через катетер до и через

15, 30, 45 мин, I, 2, 3, 5, 6, 7 ч после пгиема ранитидинг. Кровь центрифугировали при 3000 об/мин. Плазму отбирали и хранили при -20 С. К 1 мл плазмы добавляли 0,5 мл 0,001 И NaOH для создания рН 8,7 и 15 мл хлороформа. После 10-минутного встряхивания водную и органическую фазы разделяли центрифугированием (5 мин при

3000 об/,;ин), водную фазу удаляли, а органическую упаривали при 40 С

qocyxa с помощью роторного испарителя Rotavapor. k-110 (фирмы "Buchi", ФРГ). Сухой остаток растворяли в

0,5 мл подвижной фазы, аликвоту (0,05 мл) наносили на колонку. Определение ранитидина проводили на жидкостном хроматографе "Altex" 110 А (США) с инжектором на 0,05 мл и колонкой (250х4,6 мм) с неподвижной фазой Spherisorb ODS 5 мкм, Подвижной фазой служила смесь ацетонитрил

54 КС1 + 0,1i СН,СООН в воде в соотношении 8:92 (по объему), скорость элюирования 1,5 мл/мин. Детектирование проводили с помощью спектрофотометра "Hitachi 100-40 на длине волны 228 нм. Результаты приведены в табл. 5.

Пример 6. Больной П., 32 года, поступил в 11-е терапевтическое отделение 23 ГКБ с диагнозом - язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки. Ранисан (ранитидин фирмы "Здравле", Югославия) назначали перорально в дозе 150 мг. Забор крови проводили иэ локтевой вены через катетер до и через 15, 30, 45 мин, 1, 2, 3, 5, 6, 7 ч после приема ранитидина..

Кровь центрифугировали при

3000 об/мин. Плазму отбирали и храо нили при -20 С. К 1 мл плазмы добавляли сухой карбонат натрия до насыщения (150 мг) для создания рН=8,5 и 15 мл хлороформа. После 10-минутного встряхивания водную и органичес" кую фазы разделяли центрифугированием (5 мин при 3000 об/мин), водную фазу удаляли, а органическую упаривали досуха при 40 C с помощью ротор1571503

Т а б л и ц а 1

Показатель

Время, мин

1 1 1

0 5 10 15 30 60 120 240 300 360

Высота хроматографического пика (дел. шкалы)

Концентрация (мкг/мл) 0 256 132 88 77 50 31 17 14 10

0 13,9 7,0 4,6 3,9

Таблица 2

Показатель

Время, мин

Высота хроматографического пика (дел. шкалы)

Концентрация (мкг/мл) 0 244 1г6 84 74 47 30 16 13

0 13,2 6,5 4,1 3,6 2,2 1,3 0,5 0,4 0,2 ного испарителя Rotavapor R-110 (фирмы "Buchi", ФРГ). Сухой остаток растворяли в 0,5 мл подвижной фазы, аликвоту (0,05 мл) наносили на колонку.

Определение ранитидина проводили на жидкостном хроматографе "Altex" 100 А (США) с инжектором на 0,05 мл и колонкой (250х4,6 мм) с неподвижной, фазой SpherisогЪ 5 мкм. Подвижной, фазой служила смесь ацетонитрил 5Ж KCl + 0,13 СНзCOOH в воде в соот,,ношении 8:92 (по объему); скорость

-i элюирования 1,5 мл/мин. Детектирова, ние проводили с помощью спектрофото,метра "Hitachi" 100-40 на длине вол ны 225 нм. Результаты приведены в табл. 6.

В табл. 7 представлены данные, обо: сновывающие выбор оптимальной длины

; волны при определении циметидина и ранитидина.

Предлагаемый способ дает возможность надежно определять концентрации двух основных типов Н -гистаминобло- 25 каторов — циметидина или ранитидина, что позволяет контролировать их клиническую эффективность с помощью фармакокинетических исследований на доступных отечественных реактивах при повышении точности определения: в прототипе коэффициент вариации — бо( лее 63, s предлагаемом способе - не более 3,84 (см. табл. 8),.

Формула изобретения

Способ определения циметидина или ранитидина в плазме крови путем экстракции образца органическим растворителем, разделения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке, заполненной силикагелем, с обращенной фазой с последующим спектрофотометрическим определением, 1 отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, рН плазмы доводят до 8,2-8,7 сухим карбонатом натрия, экстракцию проводят хлороформом, в качестве подвижной фазы используют смесь ацетонитрила с 53-ным водным раствором хлорида калия на

0,13-ной уксусной кислоте в объемном соотношении 8:92, спектрофотометрическое определение циметидина проводят при длине волны 218-222 нм, а ранитидина - при длине волны 222228 нм.

2,3 1,3 0,5 0,4 0,2

1571503

Таблица 3

Показатель

Высота хроматографического пика (дел. шкаг<ы)

Концентрация (мкг/мл) Т а б л и ц а 4

Показатель

Время, мин

Высота хроматографического пика (дел. шкалы)

Концентрация (нг/мл) Таблица 5

Показатель

Время, мин

Таблица 6

Показатель Время, мин

0 15 30 45 60 120 180 300 360

Высота хроматографического пика (дел. шкалы)

Концентрация (нг/мл) 0 8 19 28 43 50 64 23 16

0 56,3 133,8 197,1 302,7 380 383,7 161,9 112,6

Высота хроматографического пика (дел. шкалы)

Концентрация (нг/мл) 0 278 144 96 84 54 34 18 15 . 11

0 13,6 6,8 4,4 3,8 2,3 1,3 0,5 0,4 0,2

О 15 (30 ) 4 60 $ 180 l 180 1 300 t ЗбО

0 7 17 25 38 45 57 21 14

0 55,4 131,2 195,6 300 375,5 378,8 159,8 111

0 15 30 45 60 120 180 300 360

ЮФ

0 6 16 23 35 42 53 19 13

0 56,9 134,5 199,8 305 384,6 388 170 5 113

1571503

Та бди ца

Длина волны, нм

Пример

220

218

228

222

210

225 ц р

Ц P

Ц P

Ц P

Ц P

1,2 0,9 1,6 1,1 1,2 1,1 1,6 1,1 1,8 1,6 2,0 1,3 1,9 1,1

0,5 0,4 0,4 0,4 0,5 0,4 0,6 0,5 0,7 0,4 0,6 0,4

0,4 0,3

П р и м е ч а н и е: Ц - циметидин; Р - ранитидин„

Т а б л и ц а 8

Концентра- Высота хромация цимети- тографическодина, мкг/мл го пика, дел. шкалы

Коэффициент вариации, В

6,0

6,0

5,5

6,0

6,0

0,1

О,1

0,1

0,1

0,1

Среднее- статистическое отклонение

20,0

20,0

20,0

20,.0

20,0

Среднее + статистическое отклонение 424+0,8

3,8

5,9+0,2

425,0

42,О

424,0

423,5

425,5

0,2

Составитель Н. Гуляева

Техред M.äèäûê

Редактор А. Маковская

Корректор М. Кучерявая

Заказ 1508 Тираж 531 Подписное

ВНИ П

НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул.Гагарина 101

1

3

5 б.

8

Среднее

Статистическое отклонение

Статистическая ошибка

95 35 110 58

95 34 112 56

97 35 108 56

94 35 111 57

96 33 110 56

95 36 113 57

94 34 109 55

94 35 112 58

93 34 110 55

94,8 34,6 110,6 56,4

112

114

114

112

113

113

112

113,3

60 110 70

58 110 71

60 112 69

59 109 71

57 108 70

58 110 70

58 108 72

57 112 69

58 112 69

58,3 110,1 70, 100 75

97 74

99 75

96 73

100 72

98 .71

95 75

96, 72

97 72

1 97,6 73,2

80 65

80 66

76 65

78 69

77 68

76 67

78 67

82 66

78 66

78,3 66

70 50

72 48

66 48

68 "9

68 50

71 47

70 49

68 48

68 47 ,6 69,0 48,4;