Способ получения @ -амилазы

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению ферментов. Цель изобретения - повышение степени очистки фермента. Получение очищенной α-амилазы необходимо для изучения ее роли в иммунитете при холере. Способ получения амилазы заключается в культивировании холерных вибрионов классического биовара, серовара инаба, штамма 569В в реакторе-ферментере в условиях аэрации глубинным методом, лизисе клеток 0,2%-ным едким натрием при PH 10,5, нейтрализации среды доведением PH до 8,0 4,4%-ной соляной кислотой, инактивировании культуры 0,1%-ным мертиолатом, центрифугировании реакторной жидкости при 6000 G, насыщении надосадка, содержащего фермент, сульфатом аммония до 0,6, центрифугировании при 6000G с целью получения осадка, обессоливании растворенного в трис-HCI буфера осадка на колонке с акрилексом Р-60 и гельхроматографии обессоленного препарата на колонке с биогелем А-150М в 0,005М трис-HCI буфера PH 7,6. 1 ил. 10 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51) 5 С 12 N 9/28

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОЗНРМТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4444180/30-13 (22) 12.05.88 (46) 23,06.90. Бюл. У 23 (71) Всесоюзный научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" (72) Ю.Ю. Елисеев, Н.В. Майоров и А.К. Адамов (53) 577.15(088.8) (56) Галич И.П. Амилазы микроорганизмов. — Киев; Наукова думка, 1987, 192 с.

Молодова Г.А. Ферменты микроорганизмов ° — M, Наука, 1973, с. 250-257. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ о(-АМИЛАЗЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению ферментов. Цель изобретения — повышение степени очистки фермента. Получение очищенной о -амилазы необходимо для изучения ее роли в иммунитете при холеИзобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению ферментов, и может быть использованс в научной и лабораторной практике.

Целью изобретения является повышение степени очистки фермента.

Способ получения o(-амилазы содер:жит культивирование холерных вибрионов классического биовара, серовара

Инаба, вакцинного штамма 569В в реакторе-ферментере, щелочной лизис при рН 10,5, нейтрализацию кислотой, инактивацию культуры холерных вибрионов мертиолатом, центрифугирование, фракционирование супернатанта суль„„Я0„„15 3О25 А 1

2 ре. Способ получения амилазы заключается в культивировании холерных вибрионов классического биовара, серовара Инаба, штамма 569В в реакторе-ферментере в условиях аэрации глубинным методом, лизисе клеток 0,27.-ным едким натрием при рН 10,5 нейтрализации среды доведением рН до 8,0 4,4Ж-ной соляной кислотой, инактивировании культуры 0,17.-ным мертиолатом, центрифугировании реакторной жидкости при

6000 g, насыщении надосадка, содержащего фермент, сульфатом аммония до

0,6, центрифугировании при 6000 g c целью получения осадка, обессоливании растворенного в трис-НС1 буфера осадка на колонке с акрилексом Р-60 и гсльхроматографии обессоленного препарата на колонке с биогелем А-150М в 0,005М трис-НС1 буфера рН 7,6. 1 ил

10 табл. фатом аммония, хроматографическое обессоливание и очистку методом гельфильтрации на колонке с биогелем

А-150М.

На чертеже приведен характерный тип хроматографического профиля.

Пример 1. В качестве источника фермента применяют холерные вибрионы классического биовара, серовара Инаба, вакцинного штамма 569В. Выращивают холерные вибрионы в реакторе-ферментере в течение 10 ч в условиях аэрации при 34-36 С глубинным методом на бульоне из ферментативного гидролизата казеина, содержащего

1573025

200 мг аминного азота, 2% пептона;

0,57 NaC1; 0,057 двузамещенного фосфата натрия, рН 8,0. Культивирование вибрионов продолжают до концентрации

55-65 млрд микробных клеток в 1 мл.

Культуру клеток обрабатывают щелочью. Максимальный выход наблюдается при концентрации щелочи 0,2%, что соответствует конечному значению рН

10,5, при экспозиции 18 ч, Для доведения рН среды до исходного значения 8,0 щелочь нейтрализуют

HCl в конечной концентрации 4,47..

Значения степени очистки амилазы (по, конечному результату) в зависимос. ти от концентрации NaÎH и времени ко такта приведены в табл. 1,,,Показатели жизнеспособности холерI ных вибрионов при числе опытов 5 в зависимости от концентрации мертиолата, приведены в табл. 2.

:Инактивирование жид <ой реакторной ! культуры холерных вибрионов проводят ме тиолатом. Оптимальной является

25 концентрация 0,17..

Выбор концентрации 0,1Х обусловлен повышением надежности действия мертиблата, так как при 0,08Х инактивирование культуры не происходит. Увеличение дозы свыше 0,11Х не изменяет

30 бактерицидного действия, однако при этом происходит повьппенный расход дорогостоящего препарата.

После инактивирования жидкой реакторной культуры и постановки тестов, подтверждаюпцлх ее стерильность (в соответствии с требованиями режима работы с возбудителями особо опасных инфекций), культуральную ходкость центрифугируют для отцеления осадка кЛеток вибрионов.

Влияние условий центрифугирования на эффективность формирования осадка при числе опытов 3 показано в табл,З.

Оптимальным режимом при отделении 45 клеток из культуральной жидкости является центробежное ускорение 4000g6(300g в течение 25-30 мин. При 4000g четкий осадок клеток формируется начиная с ЗО мин; при 5000g — с 25 мин; 50 при 6000g — с 15 мин. В целях сокращения времени и экономии электроэнергии для отделения клеток от культ ральной жидкости используют ускорение

6000g в течение 15 мин.

Центрифугирование проводят при температуре не вьппе 4 С.

После центрифугирования осадок, содержащий разрушенные клетки, отбрасывают, надосадок, содержащий фермент, переносят в трехлитровую емкость и добавляют к нему сульфат аммония до

60% насыщения (на 1 л надосадка 390 г сухой соли), растворяют, перемешивают и оставляют для формирования осадка при комнатной температуре на 6 ч. Указанные условия являются оптимальными с точки зрения конечной степени очистKH

Результаты эффективности очистки амилазы (по конечному результату) при числе опытов 3 в зависимости от концентрации (NH) SO< и времени контакта приведены в табл. 4.

Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием. Оптимальными условиями центрифугирования являются

6000g в течение 10 мин (табл. 5). Центрифугирование проводят при 4 С, число опытов равно 3.

Отделившийся осадок растворяют в

0,005 М трис-НС1 буфере, рН 7,6-7,7 в соотношении 1:1 и наносят на колонку с акрилексом Р-60. Указанные молярность и рН буфера подобраны экспериментально и являются оптимальными (табл. 6), количество опытов равно 3.

Соотношение объемов буфера и осадка, выбранное для растворения последнего, также установлено экспериментально. Самая эффективная (104 раза) очистка амилазы по конечному результату достигается именно в таком соотношении. При избытке буфера, т.е. превынении объема осадка в 1,25; 1,5;

2 раза и более, эффективность очистки соответственно составляет 90; 76;

68 и менее раз. При недостатке буфера, т.е. если объем в 1,25; 1,5; 2 и т.д. раз меньше, чем объем осадка, эффект очистки амилазы снижается и соответственно составляет 96, 86 и 58 раз. При объеме буфера меньшем объема осадка более, чем в 2 раза, отмечается лишь частичное растворение последнего, а следовательно, и невозможность нанесения образца на хроматографическую колонку.

Обессоливание проводят на колонке с акрилексом P-60. Указанный тип биогеля выбран потому, что только при его использовании происходит эффективное разделение (обессоливание) белкового осадка на ферментсодержащую и низкомолекулярную фракции. Сбор элюата производят под контролем оптической плотности при длине волны 280 нм

1573(с помощью проточной спектрофотометрической кюветы.

При обессоливании из колонки выходят 2 пика: белковый, ферментсодержащий и солевой (содержит сульфат аммония, мертиолат и др.).

Условия проведения хроматографии на колонке с биогелем Р-60: характеристика биогеля: пределы фракциониро- 10 вания по мол. м. 3000-60000 а.е,м.; размеры колонки 75 х 200 мм; объем геля 500 мл; скорость элюции 350400 мл/ч; рабочий буфер 0,005 М трис-HCI рН 7,6. -15

Хроматографическую колонку с акри.лексом P-60 уравновешивают тремя объемами указанного буфера. На поверхность наносят 150 мл растворенного в буфере. ферментсодержащего осадка. 20 .Полноту обессоливания оценивают качественной реакцией элюата с насыщенным раствором хлористого бария.

После того, как основная часть обессоленного ферментсодержащего белка вы-25 ходит из колонки, производят отбор элюата по 0,2-0,5 мл. К этому объему добавляют 1-2 капли раствора хлористого бария. При образовании белого осадка, указывающего на наличие ионов SOi,30 сбор элюата прекращают, Процент потери на колонке при обессоливании рассчитывают по соотношению общего количества нанесенного и.полученного после обессоливания ферментного белка (число опытов 3, табл. 7).

Потери по белку составляют З, по активности потерь не было. Напротив, отмечается увеличение активности амилазы на 105, т.е. приблизительно в 40 два раза.

На заключительном этапе получения амилазы применяют гельхроматографию на колонке с биогелем А-150А. Гель выбран в связи с тем, что только он

45 обладает эффектом разделения бессолен-ной ферментсодержащей белковой смеси (табл. 8) °

Условия проведения хроматографии на колонке с биогелем А-150 М: характеристика биогеля: предел исключения

5Î по белку до 150 млн а.е.м.; размеры колонки 45 х 400 мм; объем геля

550 мл: скорость элюции 30 мл/ч; рабочий буфер 0,005 M трис-НС1, рН 7,6.

Биогель уравновешивают тремя объемами указанного буфера, На поверхность

)25 б наносят 45 мл обессоленного ферментсодержащего раствора. Фракции по

5-7 мл собирают на автоматическом коллекторе. Каждую фракцию изучают на содержание белка (по поглощению длины волны при 280 нм и более объективно по методу Лоури) z» на активность амилазы. Из колонки выходят три белковых пика, склон первого пика содержит фермент амилазу.

В табл. 9 указаны результаты оч»»стки на разных этапах при числе опытов, равном 30.

Конечной формой хранения очищенной о(-амилазы является раствор, охлажденный до 4 С ° В растворе элюирующего буфера в таких условиях препарат может храниться до четырех месяцев, сохраняя исходную активность, при комо натной температуре (20-25 С) наблюдается потеря ферментативной активности (число опытов равно 3, табл. 10).

Формула изобретения

Способ получения с -амилазы, заключающийся в обработке исходного мате-. риала, фракционировании экстракта сульфатом аммония, центрифугировании осадка с последующим обессоливанием, отличающийся тем, что, с целью повьппения степени очистки фермента, в качестве исходного материала используют холерные вибрионы классического биовара, серовара Инаба, вакцинного штамма 569В в концентрации (55-65) 10 клеток/мл, лизируют их едким натром при значении рН суспензии клеток 10,5 в течение 18 ч для выхода фермента из периплазматического пространства в культуральную жидкость, нейтрализуют среду доведением рН до

8,0 соляной кислотой, инактивируют культуру 0,09-0,11%-ным мертиолатом, центрифугируют реакционную жидкость, насьпцают,надосадок сульфатом аммония до 0,6, центрифугируют для получения осадка, обессоливают растворенный в

0,005 И трис"IIC1 буфере рН 7,6-7,7 осадок при соотношении буфер осадок

1:1 на колонке с акрилексом Р-60 и хроматографируют обессоленнйй препарат на колонке с биогелем А-150А, элюируя при этом фермент 0,005 И трис-НС1-буфером рН 7,6, 1573025

Таблица

Концентра Эффект очистки, раз, в зависимости от времени воздействия щелочи, ция ЫаОН, ч

1 5 10 15 16 17

18 19 20 24

57 68 70 76

57 83 82 84

75 80 92 92

76 78 91 96

78 82 97 100

87 91 93 97

75 81 91 95

78 73 70 65

Таблица 2

Жизнеспособность холерных вибрионов

Концентрация

i.åpYHoëàòà, %

П р и м е ч а н и е. "+" — вибрионы жизнеспособны; и вибрионы убиты.

Таблица 3

Центробежное Образование осадка клеток при времени, мин

10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

+ + +

+ + + + +

+ + + + +

+ + + + +

+ + + + +

0,1

0,15

0,17

0,19

0,2 0,21

l0,23

0,3

7000

55 57

56 58

58 68

66 71

68 70

74 78

70 73

67 71

0,01

0,03

0,05

0,08

0,09

0,10

0,11

0,15

86 80 83 80

86 83 80 78

92 90 83 85

98 95 84 79

104 100 86 79

96 96 86 77

98 95 82 71

65 45 42 41

Таблица 4

1573025

Эффективность очистки, раз, при времени, ч

2 3 4 5 6 7 9 12 16 18

Процент насыщения сульфатом аммония

1 1

86 96

81 87

84 85

87 86

74 81

77

78

83 84

82 83

78 79

72

80 .

Таблица 5

Наличие белкового осадка при, мин

Центробежное ускорение

10 15 20 30

П р и м е ч а н и е . "- " — осадок не отделяется, "+ — осадок рыхлый, возможны потери белка при отделении, "+" — плотный отделившийся осадок.

Та блица 6

Степень очистки, раз, в зависимости от рН трис-НС1 буфера

Молярность трис-НС1 буфера

7 ° 0 7в3 7в5 7юб

1 ! 7,7 J 8,0

0,003

0,004

0,005

0,006

0,007

61 68 78 98

65 72 83 99

78 86 .98 104

80 82 90 98

81 82 88 97

98

96

98

102

98

Таблица 7

Концентрация белка, мг/мл

Общее Активность количес- амилазы,. тво бел- ед/мл

Объем ферментсодер жащего препарата, мл

Общая активность ед/мл(7) Потери белка, z ка, мг и>

2720 (100)

2650 (97) до обессоливания

400 после обессоливания 500

6,8

5 6

2240 (100)

4600 (205) 5 3.9,2

7000 о

\ Ф

29 29 38

80 80 80

104 103 104

90 93 94

88 88 89

88 89 90

81 83 85

14 14

36 39

80 76

104 103

93 94

89 90

86 89

90 84

4 7

6 7

13 15

40 38

82 80

102 104

94 94

90 89

88 84

85 87

1573025

Таблица 8

Эффект разделения

Число опытов

Нет

Есть

Таблица 9

Белок мг/мл

М+ и

Исследуемый материал

Степень очистки

Активность, усл.ед.

М+п

Надосадок культуральной жидКости после отделения фрагментов клеток вибрионов

0,32+0,08

12,8+1,4 4,1+0,5

Обессоленный ферментсодержаЩий препарат после элюции ка

Колонке с биогелем Р-60

5,3+0,23 9,2+0,6 i,74+-0, /

5,4 .

Склон первого пика на колонке с биогелем А-150 M

104,2

0,23+0,09 7,7+0,6 33,59+1,2

Таблица 10

Активность фермента в единицах на 1 мг белка при сроке хранения, мес

Условия хранения

1 2 3 4 5 -6

Комнатная температура (20-25 С)

Холодильник (+4 C) 33,6 26,4 20,8 16,2 8,0

33,6 33,4 33,3 33,3 30,2 28,4

t,5 и 10 60 N Ю le Ж)Ю Ю 200мл

Составитель А. Семенов

Редактор Н. Бобкова Техред M,Xoäàíè÷ КорректорП.Патай

Тираж 481

Подписное

Заказ 1621

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, 8-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.,Óæãîðîä, ул. Гагарина, 101

3

3

30

А — 0,5 М

А- 1,5М

А — 5 М

А- 15M

А-50М

А- 150М

tt

II

11

Удельная активность, ед/мг бел.

М + и