Способ выделения ферментов с протеолитической и амилолитической активностью из @ @

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТ ИЧЕСНИХ

РЕСПжЛИН (19) (11) (51)4 С 12 N 9/28, 9/62//(С 12 N 9/62, С 12 R 1:645) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБ ЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

* юъ., E ." --,, ...,*

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ l3,К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3637983/28-13 (22) 23.08.83 (46) 28.02.86. Бюл. Ф 8 (72) И.П.Галич, M.Â.Êoëoäçåéñêàÿ, P.ß.Áåéíàðoâè÷às А.Я.Кестерс, В.Х.Кирсис, И.К.Шпрунка и С.Я.Скуиня (53) 577.15,07(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

Ф 885253, кл. С 12 N 9/28, 1980.

Авторское свидетельство СССР

1(s 727681, кл. С 12 К 1/02, 1977. (54)(57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФЕРИЕНТОВ

С ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ И АМИЛОЛИТИЧЕСКОЙ

АКТИВНОСТЬЮ ИЗ ASPERGILLUS ORYZAEs включающий экстракцию,центрифугирование, осаждение этанолом и сернокислым аммонием, диализ и лиофилиэацию, отличающийся тем, что, с целью повышения активности ферментов при их дифференцированном выделении щелочных протеиназ и с(, -амилаэы, осаждение этанолом с температурой от минус 15 до минус о

20 С проводят при соотношении центрифугат: спирт 1;(0,9-1,05) и иэ полученного после центрифугирования осадка, растворенного в воде сернокислым аммонием при степени насыщения 0,73-0,80, осаждают щелочные протеиназы, а из центрифугата осаждают е(, -амилазу сначала охлажденным до минус.!5 минус 20 С этанолом при соотношении центрифугат:

:спирт 1:(0,85-0,92), а затем сернокислым аммонием при степени насыщения 0,70-0,83.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве сырья используют препарат амилориэин.

9 12

Изобретение относится к биотех-. нологии, к способам получения ферментных препаратов из микробиаль"ного сырья. Получаемые ферменты (oC-амилаза и щелочные протеинаэы) находят широкое применение в народном хозяйстве.

Целью изобретения является повышение активности получаемых ферментов при их дифференцированном выделении щелочных протеиназ и х --амилаэыа

Способ включает стадии экстракции сырья — обычно амилориэина, центрифугирования и дифференцированного выделения иэ центрифугата щелочных протеиназ, осаждение охлажденным до (-) 15 — (-)20 С этанолом при соотношении центрифугат: спирт 1;(0,9-1, 05) с последующим осаждением их сернакислым аммонием при степени насьпцения 0,73-0,80 и с -амилазы из центрифугата, полученного после осаждения щелочных протеиназ этанолом, осаждение сначала этанолом при (- "l5) — (- 20 С) при соотношении центрифугат: спирт 1:(0,850,92), а затем сернокислым аммонием при степени насыщения 0,70-0,83.

Пример 1. 2 кг амилоризина суспендируют в семикратном объеме деминералиэованной воды при комнатной температуре и перемешивают в течение 0,5 ч. Экстракт ферментных белков отделяют от нерастворимых примесей путем центрифугирования . при 4500 об/мин (3400 ) ) в течение

45 мин. К 12 л экстракта при температуре 4 С добавляют i?„6 л 96%-ного этилового спирта, предварительно охлажденного да -20 С до конечной концентрации 50% для осаждения щелочных протеинаэ (соотношение центрифугат: спирт 1:1 05, Центрифугируют при 4500 аб/мин (3400 < ) в течение 40 мин при температуре

4-5 С. Иэ осадка выделяют щелачные протеиназы, а из центрифугатам-амилазу.

После центрифугирования осажденный белок 1,2 кг растворяют в 1,6 л деминерализованной воды. К 2,4 л раствора щелочных протеинаэ добав= ляют 1,35 кг сернокислого аммония до насыщения 0,73 в течение ЗО мин при непрерывном перемешивании и о температуре 4-5 С. Смесь оставляют в холодильнике на 15 ч. Центрифуги14755 2

1Î

)5

)0

ЗО

40 ..)5 руют при 10000 об/мин (7000 cj ) в течение 1 ч при температуре 4-5 С.

Осажденный белок растворяют в

0,4 л демннералиэованной воды, о охлажденной до 4-5 С.

Ферментный раствор диалиэируют против 0,0005 М раствора уксуснокислого кальция лри 4 С до исчезновения реакции на сульфат-ионы. Полученный ферментный препарат лиофилиПолучают 15,2 препарата щелочных лротеиназ с активностью 0,67 ед/мг препарата (по методу Каверэневой с использованием в качестве субстрата казенка).

Выход по активности составляет 45%.

К 23 л центрифугата, полу-ченнога лри осаждении щелочных протеиназ, добавляют 21 л 96%-ного этанола, о охлажденного до -20 С (соотношение центрифугат:спирт 1:0,92), перемешивают, Через 15-?О мин надосадочную жидкость декантируют и используют для регенерации спирта. Осадок (0,7 кг) растворяют в 6 л деминерализованной воды, добавляют

2,0 л 0,5 N раствора уксуснокислого кальция до конечной кочцентрации

0,125 И. Бз стабилизированного уксуснокислым кальцием раствора, рП

6,0-6„3 (скециально не устанавливается),, осаждают g -амилазу, добавляя 4,13 кг сернокислого аммония при.перемешивании (0,7 насьпцения).

Через 2 ч осадок отделяют центрифугированием при 4500 об/мин (3400 ) в течение 1 ч. Полученный осадок суспендируют в 4 л охлажденной до и

2-4 С деминерализованной воды, диализируют против 0„0025 И раствора уксусно-кислогс кальция до отсутствия реакции на сульфат-ионы. Вы- . ход 50,5 г v! --амилазы с активностью

211 ep/мг препарата, 264 ед/мг белка (ло модифицированному методу Бернфельда)-. Содержание белка в препарате 80%. Выход ло активности 81%.

Пример 2. 2 кг амилоризина суспендируют в семикратном объеме деминералиэованной воды при комнатной температуре и перемешивают в течение 0,5 ч. Экстракт ферментных белков отделяют от нерастворимых приме ей путем центрифугирования при 4500 об/мин (3400 ) в течение

45 мин. К )0 л экстракта при температуре 4 С добавляют 9,3 л 96%-но о этиловогс спирта, предварительно

1214755

Составитель О. Скородумова

Редактор Л. Повхан Техред З.Палий Корректор M. Максимишинец

Подписное

Заказ 858/39 Тираж 490

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 охлажденного до -15 С до конечной концентрации 50 для осаждения щелочных протеиназ (соотношение центрифугат:спирт 1:0,9). Центрифугируют при 4500 об/мин (3400 ) в течение 40 мин при температуре о

4-5 С. Иэ осадка выделяют щелочные протеинаэы, а из центрифугатаюс-амилаэу.

После центрифугирования осажденный белок 1,2 кг растворяют в 1,5 л деминерализованной воды. К 2 5 л

) раствора щелочных протеиназ добавляют 1,52 кг сернокислого аммония до насыщения 0,8 в течение

30 мин при непрерывном перемешивании и температуре 4-5 С. Смесь оставляют в холодильнике на 15 ч. Центрифугируют при 10000 об/мин (7000 ) в течение 1 ч при температуре 4-5 С, Осажценный белок 0,65 кг растворяют в 3,5 л деминерализованной воды, охлажденной до 4-5 С.

Ферментный раствор диалиэнруют против 0,0005 М раствора уксуснокислого кальция при 4 С до исчеэноо вения реакции на сульфат-ионы.

Полученный ферментный препарат лиофилизируют. Получают 15,2 г сухого препарата щелочных протеиназ с активноетью 0,62 ед/мг препарата (по методу Каверэневой с использованием в качестве субстрата казеина). Выход по активности составляет

40Х.

К 21,9 л центрифугата, полученного при осаждении щелочных протеинаэ, добавляют 18,6 л 96Х-ного зтао нола, охлажденного до -15 С (соотношение центрифугат:спирт,1:0,85), перемешивают. Через 15-20 минут надосадочную жидкость декандируют и используют для регенерации спирта.

Осадок (0,6 кг) растворяют в

10 5 л деминерализованной воды, добавляют 1,25 л 0,5 И раствора уксуснокислого кальция до конечной концентрации 0,125 М. Из стабилизированного .уксуснокислым кальцием

15 раствора, рН 6,0-6,3 (специально не устанавливается), осаждают

oc -а м и ла з у,, д о б а в л я ют 44,0 кг сернокислого аммония при перемешива- нии (0,83 насыщения). Через 2 ч ур осадок отделяют центрифугированием при 4500 об/мин (3400 g ) в течение

1 ч. Полученный осадок суспендируют в 4 л охлажденной до 2-4 С деминерализованной воды, диали25 зируют против 0,0025 И раствора уксуснокислого кальция до отсутствия реакции на сульфат-ионы.

Выход 65,0 г Ot, -амилазы с активностью 255 ед/мг препарата, 300 ед/мг белка {по модифицированному методу Бернфельда). Содержание белка в препарате 85Х. Выход по активности 82Х.

Технико-экономическая зффектив35 ность способа заключается ч повышении активности получаемых ферментов.