Способ определения жизнеспособности клеток

 

Изобретение относится к области биотехнологии, а также может быть использовано в медицине, в экологии и охране окружающей среды, в фундаментальной биологии клетки, при контроле за состоянием клеточных культур. Целью изобретения является повышение точности способа. Для этого окрашивание анализируемой суспензии клеток производят смесью красителей акридиновый оранжевый и бромистый этидий в соотношении 1:3. Доли живых и мертвых клеток регистрируют путем автоматического раздельного подсчета на проточном цитофлуориметре числа тех и других клеток, различающихся по интенсивности свечения (в одном спектральном диапазоне). Повышение точности способа достигается в результате устранения перекрывания областей распределения (по интенсивности свечения) двух типов клеток, снижение трудоемкости анализа и его удешевление - за счет появления возможности применения более простых в эксплуатации отечественных регистрирующего устройства (одноканального проточного цитофлуориметра) и красителя (акридинового оранжевого).

247 А1

09) (11) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

Il0 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

IlPH ГКНТ СССР (21) 4369708/30-13 (22) 08. 1 2. 87 (46) 30.09..90. Бюл. и 36 (71) Институт цитологии АН СССР (72) А.Е. Виноградов, Е.В. Гусев и Ю.N. Розанов .(53) 579.858(088.8) (56) Цитология, 1987, т. XXIX, Р 9, с. 1099. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК (57) Изобретение относится к области биотехнологии, а также. может быть использовано в медицине, в экологии и охране окружающей среды, в фундаментальной биологии клетки, при контроле за состоянием клеточных культур.. Целью изобретения является повышение точности способа. Для этого окрашивание анализируемой суспензии клеток

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к контролю sa состаянием клеточных культур, и может быть использовано в токсикологии, цитодиагностике и в экологии и охране окружающей среды (тестирование за" гряэнений на цитотоксичность

Целью изобретения является повыше-ние точности способа.

Изобретение заключается в том,.что при окрашивании суспензии клеток в. качестве красителя используют смесь акридинового оранжевого (A0 ) и бромистого этидия (БЭ} в соотношении

1:3 (напр. 7 мкг/мл АО и 20 мкг/мл (gg)g G 01 N 33/48, 21/64

2 производят смесью красителей акридиновый оранжевый и бромистый этидий в соотношении 1:3, Доли живых и мертвых клеток регистрируют путем автоматического раздельного подсчета на проточном цитофлуориметре числа тех и других клеток, различающихся по интенсивности свечения (в одном спектральном диапазоне), Повышение точности способа достигается в результате устранения перекрывания областей распределения (по интенсивности свечения) двух типов клеток, снижение трудоемкости анализа и его удешевление - за счет появления возможности применения более простых в эксплуатации отечественных регистрирующего устройства (одноканального проточного цитофлуориметра) и красителя (акридинового ооанжевого).

БЭ для концентраций клеточных суспензий (0,5-3). 10 кл/мл), а различия в флуоресценции живых и мертвых клеток регистрируют по интенсивности их свечения в одном и том же спектральном диапазоне.

Это позволяет раздвинуть и стабилизировать положения максимумов кривых распределения живых и мертвых клеток на гистограмме, а также сузить область распределения живых клеток примерно в 3-4 раза по сравнению с прототипом (не меняя общей площади под кривой распределения), и таким ,образом полностью исключить основной

1596247

1 источник ошибки. анализа - перекрывание областей распределения двух типов клеток. Регистрация различий по интенсивности фпуорвсценции позволяет 5 заменить дорогостоящее импортное оборудование на отечественное, а применение более простой в эксплуатации смеси красителей (АО вместо флуоресцеиндиацетата ФДА) снижает трудовм- !О кость способа и дает возможность использовать более доступный отечественный реактив.

В этой смеси широко используемый краситель АО проявляет новое свойство - способность окрашивать живые и мертвые клетки таким образом, что они отличаются друг от друга не только разным цветом свечения, но и интенсивностью этого разноцветного свечения. щ0

Это дает возможность регистрировать дифференциацию живых и мертвых клеток одним фотоэлектронным детектором в одной полосе флуорвсценции, применив для этого ОднОканальный протОчный цитофлуориметр. Такая регистрация обеспечивает автоматизацию. процесса анализа, объективность результатов и, как следствие этого, болев высокую точность, а также быстроту их получения.

Пример 1. К 1 мл каждой из

10 идентичных проб. анализируемой суспензии лимфоцитов человека (фракцию мононуклеарных клеток выделяют из

35 крови здоровых доноров с помощью центрифугирования).в среде 199 (концентрация 1,2 106 кл/мл ) добавляют

20 мкл раствора бромистого этидия (концентрация 1 мг/мл/ и 7 мкл раст" вора акридинового оранжевого (концентрация 1 мг/мл ). Перемешивают и инкубируют 20 мин при 20 С. Далее пробы анализируют на проточном цитометре.

Получают 10 сходных гистограмм. Ана- 45 лиз гистограмм дал результат: живых клеток 92+3%. одновременно те же окрашенные 10 проб анализируют под микроскопом (объектив 40 < 0,65) традиционным методом, Получают ре зультат: живых клеток 84,5+ 6,5%.

Время, затраченное непосредственно на анализ методом проточной цитометрии, составляет 25 мин-для 10 проб, в то время как для проведения ана%

55 лиза тех же 10 проб традиционным методом микроскопии потребовалось 2 ч.

При этом средняя величина второго результата несколько меньше, чвм первого. Это снижение происходит эа счет гибели части клеток в процессе их подсчета под микроскопом.

Таким образом,.способ позволяет с меньшей статистической и систематической погрешностью и за меньшее время определять соотношение живых и мертвых клеток животных по сравнению с традиционным методом анализа клеток под микроскопом.

Пример 2. Отбирают 1 мл суспензии клеток тимуса мыши в растворе версена (концентрация 2 -10 < кл/мл), добавляют 20 мкл раствора БЭ (концентрация 1 мг/мл ) и 7 мкл раствора АО (концентрация 1 мг/мл ), перемешивают, инкубируют 20 мин при 20 С, анализируют 0,5 мл пробы на проточном цитофлуориметре. В канале возбуждения— светофильтр СС вЂ” 15-4, в канале регистрации — светофильтр OC-ll и "зеленая" светоделительная пластинка из набора микроскопа ЛЮМАМ И!. Регистрируют гистограмму и количество клеток в левом (9 .10! ° 10 < кл ) и правом (9 576л к10 кл ) пиках. Число клеток в пике пропорционально площади под соответствующей кривой в пределах визуально выбранных границ по оси абсцисс и подсчитывается автоматически с помощью анализатора импульсов, входящего в состав проточного цитофлуориметра. Получают результат. живых клеток 91,32%, мертвых клеток 8,68%, Параллельно с анализом на цитофлуориметре доли живых и мертвых клеток в той же окрашенной пробе подсчитывают с помощью камеры Горяева под люминесцентным микроскопом, что требует значительно больше времени и труда. Результаты этого анализа (9,1%+0,5+ мертвых клеток/ не отличаются От результатов анализа пробы на проточном цитофлуориметре в пределах 5% по относительной величине.

Пример 3. К 1 мл пробы из анализируемой суспензии клеток тимуса мыши в растворе версена (концентрация

1,5 ° 10 кл/мл) добавляют 20 мкл раствора БЭ (концентрация 1 мг/мл) и 7 мкл раствора АО (концентрация мг/мл), перемешивают и инкубируют 20 мин при

20 С. Анализируют 0 5 мп пробы на одноканальном проточном цитофлуориметре, как описано в примере 2, Регистрируют гистограмму и определяют соотношение живых (88,3%) и мертвых (!1,7%) клеток.

Составитель В.Романова

Редактор Н, Горват ТехредМ.Дндык Корректор Т, Малец

Заказ 2906 Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Рауаская наб., ц. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, уд. Гагарина,101

5 15

Одновременно к 1 мп другой пробы и этой же анализируемой суспензии добавляют 50 мкл раствора ФДА, концентрация 10 мкг/мп, и 10 мкл раствора БЭ перемешивают и инкубируют 25 мин при

20 С. Анализируют 0,5 мп этой пробы на проточном цитофпуориметре. Регистрируют соответствующую гистограмму, но соотношение живых и мертвых клеток нельзя определить из-эа невозможности точно определить область распределения мертвых клеток.

Кроме того, к 1 мп третьей пробы иэ той же анализируемой суспензии добавляют 20 мкл раствора АО, перемешивают и инкубируют 20 мин при 20 С.

Анализируют 0,5 мл этой пробы на проточном цитофпуориметре, как описано вьппе. Регистрируют соответствующую гистограмму, но соотношение живых и мертвых клеток нельзя определить иэ-эа перекрывания областей распределения живых и мертвых клеток.

Результаты сравнительного анализа всех трех зарегистрированных гистограмм показывают, что только в случае окраски клеток смесью красителей БЭ и АО области распределения живых и мертвых клеток хорошо разделяются, что дает возможность с высокой точ" ностью определить в этом случае соотношение тех и других клеток в суспензии. При окраске клеток одним краси.телем АО живые и мертвые клетки не разделяются по интенсивности их люминесценции. Известная окраска клеток смесью красителей ФДА и БЭ также не дает возможности разделять живые и

96247 6 з мертвые клетки при одноканальной регистрации.

Таким образом, при использованич способа существенно повышается точность измерения при снижении трудоемкости анализа и его удешевление эа счет появления возможности применения отечественных регистрирующего устройства и красителей. Кроме того, способ дает возможность определять соотношение живых и мертвых клеток неавтомати. зированным способом — подсчетом клеток при наблюдении под люминесцентным микроскопом (в случае отсутствия проточного цитофлуориметра), Формула и э о б р е т е н и я

Способ определения жизнеспособности

20 клеток, включающий получение суспензни клеток в солевом растворе, обработку суспензии раствором этидиума бромида в смеси с фпуорохромом, возбуждение флуоресценции в синей области спектра

25 с последующей регистрацией фпуоресценции и количественной оценкой живых и мертвых клеток по гистрограмме распределения, отличающийся тем, что, с целью повьппения точности, 3О суспенэию клеток получают с концентра-. цией (0,5-5) 10ь кл/мл, этидиум бромид используют в смеси с акрндиновым оранжевым в количестве 20 и 7 мкг/мл со» ответственно, флуоресценцию регист35 рнруют в спек1 ральном диапазоне 5 20700 нм, а оценку осуществляют на гистограмме распределения клеток по интенсивности флуоресценции в этом спектральном диапазоне.