Способ разделения субчастиц 70 s рибосом

 

Изобретение относится к молекулярной биологии и препаративной биохимии, а именно к способам получения нативных 30 и 50S рибосомных субчастиц. Целью изобретения является сохранение нативности рибосомных субчастиц и повышение их выхода. Для этого рибосомные субчастицы разделяют с помощью 2-этапной хроматографии на бутил-Тоеперл 650S: на первом этапе 70S рибосомы в диссоциирующем буфере, содержащем 500 мМ цитрата NA и 300 мМ MGCL<SB POS="POST">2</SB>, пропускают через колонку, промывают тем же буфером до исчезновения поглощения в промывных водах, а сорбированные 30S субчастицы элюируют разведенным в 5 раз исходным буфером. Промывные воды после первого этапа хроматографии, содержащие 50S субчастицы (до 90%), повторно хроматографируют на той же колонке в присутствии 150 мМ MGCL<SB POS="POST">2</SB> и IM (NH<SB POS="POST">4</SB>)<SB POS="POST">2</SB>SO<SB POS="POST">4</SB>

элюция сорбированных 50S субчастиц проводилась обратным градиентом концентрации (NH<SB POS="POST">4</SB>)<SB POS="POST">2</SB>SO<SB POS="POST">4</SB> - 0,8-0,25 М. Предлагаемый метод обеспечивает нативность рибосомальных субчастиц и их 80% выход. Метод может найти широкое применение как при исследовании аппарата трансляции генетической информации, так и для решения биотехнологических задач, связанных с биосинтезом биологических препаратов белковой природы разного назначения.

СО)ОЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ASTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

APH ГННТ СССР

I (21) 4402254/30-13 (22) 04,04.88 (46) 23. 10.90. Бюл. В 39 (71) Институт белка АН СССР (72) С.Ч.Агаларов и M.Ì.Þñóïîâ (53) 547.963.3 (088,8) (56) Авторское свидетельство СССР

В 874753, кл. С 12 N 5/00, 1977, (54) СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ СУБЧАСТИЦ

70S РИБОСОМ (57) Изобретение относится к молекулярной биологии и препаративной биохимии, а именно к. способам получения нативных 30 и 50$ рибосомных субчастиц. Целью изобретения является cîõðàíåèèå нативности рибосомных субчастиц и повышение их выхода. Для этого рибосамные субчастицы разделяют с помощью 2-этапной хроматографии на бутил-Тоеперл 650S: на первом этапе 70S рибосомы в диссоциирующем буфере, содержащем 500 мМ цитрата

Изобрегение относится к молекулярной биологии и препаративной биохимии, а именно к способам получения нативных 30 и 50$ рибосомных субчастиц.

Цель изобретения — сохранение нативности рибосомных субчастиц и повышение их выхода.

Подобраны условия разделения субчастиц 70S рибосом на гидрофобном носителе бутил-Тоеперл 650S которые обеспечивают сохранность их нативности, поскольку эффект разделения на .бутил-Тоеперл 650$ основан на различиях гидрофобных свойств, присущих нативным рибосомальным субчастицам, (51)5 С 12 Р 1/00, С 12 N 5/О(), С 07 К 3/20

Na и 300 мМ MgC1» пропускают через колонку, промывают тем же буфером до исчезнования поглощения в промывных водах, а сорбированные 30$ субчастицы элюируют разведенным в 5 раз исходным буфером. Промывные воды после первого этапа хроматографии, содержащие 50S субчастицы (до 90X), повторно хроматографируют на той же колонке в присутствии 150 мМ МяС1 и,1М (NH4)> S04, элюция сорбированных 50$ субчастиц проводилась обратным градиентом концентрации (NH4) $04 — 0,80,25 М. Предлагаемый метод обеспечивает нативность рибосоыальных субчастиц и их 803 выход. Метод может найти широкое применение как при исследовании аппарата трансляции генетической информации, так и для решения биотехнологических задач, связанных с биосинтезом биологических препаратов белковой. природы разного назначения.

Сущность изобретения заключается в 2-этапной хроматографии диссоциированных 70S рибосом на колонке с гидрофобным носителем бутил-Тое-, перл 650S,. На первом этапе используемые буферные системы обеспечивают связывание с носителем исключительно

30S субчастиц, в то время как 50S субчастицы сходят с колонки в ходе промывки, Вслед за этим проводится элюция 30S субчастиц соответствующим буферным раствором, Присутствие цит- рата Na и ионов Мд(в используемых буферных системАх посадки, промывки и элюции препятствует ассоциации субчастиц и способствует сохранению

1601120

ièõ нативности. Второй этап предусматривает концентрацию и очистку фракции 50S субчастиц при повторной хроматографии на той же колонке, но в, других ионных условиях, которые onI ределяют адсорбцию 50S субчастиц на

;; носителе. Способ позволяет получить

1 807-ный выход продукта — препаратов нативных 30 и 50S субчастиц 70Б 1Î рибосом.

Пример. 70$ рибосомы .(в количестве 150-200 мг), находящиеся в буфере> содержащем 50 мМ .трис-НС1 (рН 8,0), 500 мМ цитрата натрия, 300 мМ MgC1, 1 мМ ДТТ, наносят на колонку (8 = 2,5 см, V = 60 мл)с .. гидрофобной смолой бутил-Тоеперл 650S уравновешенной этим же буфером. Далее колонку промывают стартовым буфером 20 ,до тех пор, пока значение оптической плотности регистрируемого материала ! не выходило на плато (близкое к базо вой линии). В результате этого рибо сомные 30Б субчастицы, отличающиеся 25 по гидрофобным свойствам от 50S субчастиц, в основном адсорбировались на колонке, а последние оказывались в промывных водах. Далее ЗОБ субчастицы элюируют с колонки разбав- З< ленным в 5 раз стартовым буфером. А к промывным водам, содержащим в основном 50S субчастицы (около 90X)>, добавляют сухой (NH4) БО > до концен трации 0,5 М, при. этом увеличив кон35 центрацию MgClz до 0,5 М, и наносят на ту же колонку, уравновешенную буфером, содержащим 50 мМ трис-НС1 (рН 7,5), 1 М (NHg) БО > 50 мМ MgClz>

150 мМ NH4С1, 1 мМ ДТТ, Элюцию 50Б субчастиц проводят обратным градиентом сульфата аммония (0,8-0,25 M) на том же буфере.,Фракции основного пика оптической плотности, соответствующие 50S субчастицам, собирались. 45

Для успешного осуществления предлагаемого способа необходимо строго соблюдать следующие параметры. концентрации солей цитрата натрия, хлористого магния и сульфата аммония, допустимый интервал температурш 4S0

6 С.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает сохранение нативности конечных продуктов — 30 и 50Б рибо55 сомных субчастиц и увеличение их выхода до 80_#_. Использование для реализации данного метода стандартного хроматографического оборудования ey" щественно удешевляет и облегчает получение рибосомных субчастиц в нативном состоянии по сравнению с известным способом их получения - центрифугированием в градиенте концентрации сахарозы. Кроме того, использование предлагаемого способа позволяет снять ограничения и в количестве разделяемого материала, что достигается . увеличением объема колонки, например

300 мм новителя достаточно для хроматографии 1 r 70S рибосом. Все перечисленное позволяет охарактеризировать предлагаемый способ как простой, экономичный и высокоэффективный.

Предлагаемый способ целесообразно использовать в молекулярно-биологических исследованиях и при решении задач прикладной биохимии для крупномасштабного выделения рибосомных,субчастиц. Предлагемый способ может также найти применение и в области биотехнологии для биосинтеза биологи- ческих препаратов белковой природы различного назначения„

Формула изобретения

Способ разделения субчастиц 70S рибосом, включающий хроматографию на гидрофобном носителе, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью сохране" ния нативности субчастиц и повышения их выхода, в качестве гидрофобного носителя используют бутил-Тоеперл 650S, а хроматографическое разделение осуществляют в 2 этапа — сначала через колонку пропускают рибосомы в буферном растворе, содержащем цитрат

Na в концентрации 500 мМоль и МяС1 в концентрации 300 мМоль и элюируют адсорбированные ЗОБ- субчастицы тем же буферным раствором, разбавленным в 5 раз, прошедший через колонку раствор подвергают повторному хроматографированию в присутствии 150мМоль

MgC1< и 1 моль сульфата аммония и элюируют адсорбированные на колонке

50S-субчастицы обратным градиентом концентрации сульфата аммония,