Способ деконтаминации от микоплазм тимидинкиназодефектных перевиваемых клеточных линий спэв-тк @

 

Изобретение относится к биологии, а именно к культивированию клеток животных IN VITRO для вирусологических и биотехнологических исследований. Цель изобретения - повышение степени деконтаминации. Способ состоит в комбинированной обработке СПЭВ-ТК-клеток 5-бром-2-дезоксиуридином(150-250 мкг/мл), этонием (5-15 мкг/мл), канамицином (200-300 мкг/мл) на протяжении трех пассажей в ростовой среде. Способ отличается высокой эффективностью деконтаминации СПЭВ-ТК-клеток. На протяжении десяти пассажей (срок наблюдения) без дальнейшей обработки клетки свободны от микоплазм.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЩИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (gg)g С 12 N 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И 01НРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4638932/30-13 (22) 18.01.89 (46) 07.12.90. Бюл. Р 45 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.P.Коваленко (72) Л.П.Дьяконов, О.Ш.Расулев, Е.В.Майджи и Ш.М.Тугизов (53) 578.085.23 (088.8) (56) Неустроева В.В.Контаминация культур клеток микоплазмами, принципы и методы деконтаминации.

Дис.канд. наук. M 1969, с.10-150;

Изобретение относится к области биологии, а именно"к культивированию клеток животных in vit го для вирусологических и биотехнологических исследований.

Целью изобретения является повышение степени деконтаминации.

Пример 1. Клетки мутантного штамма СПЭВ-А4-ТК высевают в культуральные флаконы объемом 100 мл в коцентрации 0,5 х 10 кл/мл в ростовую среду, содержащую 200 мкг/мл

5-БДУ 5-бром-2-дедоксиуридин (5-БДУ), мкг/мл: этоний 10 и кана- " мицин 250. На 10-12 сут культивиро2 (54) СПОСОБ ДЕКОНТАМИНАЦИП ОТ МИКОПЛАЗМ ТИМИДИНКИНАЗОДЕФЕКТНЫХ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ СПЭВ-ТК (57) Изобретение относится к биологии, а именно к культивированию клеТоК жив oTHbIZ 1 и vi с го для BH p5 c оло гических и биотехнологических исследований, Цель изобретения — повышение степени деконтаминации. Сгособ состоит в комбинированной обработке

СПЭВ-ТК-клеток 5-бром-2-дезоксиуридином (150-250 мкг/мл), этонием (5-15 мкг/мл), канамицином (200—

300 мкг/мл) на протяжении трех пассажей в ростовой среде. Способ отличается высокой эффективностью деконтаминации СПЭВ-ТК-клеток. На протяЩ жении десяти. пассажей (срок наблюдения) без дальнейшей обработки клетки свободны от микоплазм. вания после формирования очагового монослоя клетки пересевают и повторяют цикл обработки клеток препаратами второй раз, а затем третий раз.

После третьего цикла обработки клеток микоплазмы на элективных пита— тельных средах не выявляются и результаты по ДНК-флуорохромированию клеток также отрицательны. При дальнейшем культивировании на протяжении

2 месяцев (10 пассажей) без препаратов и антибиотиков клетки свободны от микоплазм (срок наблюдения).

Пример 2. Клетки мутантногG штамма СПЭВ-13-Д5-ТК высевают в

1611929

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

Способ деконтаминации ar микоплазм тимидинкиназодефектных перевиваемых клеточных линий СПЭВ-ТК включающий обработку клеток в ростовой среде канамицином, о т л и ч а— ю шийся тем, что, с целью повышения степени деконтаминации, клетки обрабатывают канамициттом в конечной концентрации 200-300 мкг/мл среды в сочетании с 5-бром-2-дезоксиуридином с концентрацией 150250 MKr/мл среды и этоннем в конечной концентрации 5-15 мкг/мл среды, при этом обработку проводят с интервалом в 10-12 дней. культивирования.

Составитель А.Маныкнн

Техред М. Ходанич

Корректор Л, Пили-тенко

Редактор Н.Бобкова

Тираж 486

Подписное

Заказ 3812

ЬНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям и» н ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент", т .Ужгсро:I, уя. Гагарина, 101 ультуральные флаконы объемом 100 мл

Г .концентрации 1,0 х 10 кл/мл в ростовую среду, содержащую,мкг/мл:

;5-БДУ 200, этоний 10 и канамицин

250. На 10-!2 сут культивирования ,иосле формирования очагового монослоя клетки пересевают и повторяют цикл обработки клеток препаратами второй pas. После третьего цикла об работки клеток микоплазмы на элективнык питательных средах не выявляются и результаты ДНК-флуорохромирования культур раствором Хехст-33258 и оливомицином также отрицательны. 15

При дальнейшем культивировании на .протяжении 2 мес (10 пассажей) без препа„ атов и антибиотиков клетки свободны от микоплазм (срок наблюдения).

Пример 3. После криогениза- 20 ции в течение 1 мес рекультивировали . клетки штаммов СПЗВ-13-А4-ТК и

;СПЗВ-13-Д5-ТК, свободные от мико,плазм. На протяжении 5 пассажей (срок наблюдения) клетки обоих штаммов 25 ,культивировали в ростовой среде без антибиотиков. Результаты культивирования микоплазм.. на элективных питательных средах и ДНК-флуорохромирования клеток раствором Хехст-33258 и оливомицином свидетельствуют о том, что клетки штаммов СПЭВ-А4-ТК и

СПЗВ-13-Д5-ТК свободны.от микоплазм.

1 и

Пример 4, Клетки двух мутантных штаммов СПЗВ-А4-ТК и СПЭВ-13-Д5-ТК=, контаминированных микоплазмами, и тех штаммов, свободных от микоплазм, высевают в концентрации 2,0 х х 10 кл/мл в ростовой среде во фла- 40 коны с покровными стеклами. Через

24 ч культивирования проводят сгтияние клеток в монослое с помощью 50X-, ного раствора ПЭГ. Эффективностыибридизации клеток оценивают на цитологических препаратах, орошенных гематоксилинэозином по количеству гомо карионов. Процент слившихся клеток, свободных от микоплазм, почти в 2 раза для штамма СПЭВ-13-А4-ТК и в

1,5 раза для штамма СПЭВ-13-Д5-ТК превышает процент слившихся контаминированных клеток, Способ деконтаминации от микоплазм тимидинкиназодефектных клеток позволяет быстро достичь положительного результата. Целесообразно с помощью этого способа деконтамннировать клеточные линии с ТК вЂ” фенотипом и осуществлять криоконсервирование больших количеств образцов, которые затем при необходимости можно рекультивировать для проведения двух-трех, месячттых экспериментов. Способ универсален для деконтаминации от микоплазм ТК -линий клеток.