Способ выделения андрост-4-ен-3,17-диона
Изобретение относится к химии стероидов ряда андростана и касается усовершенствования способа выделения андрост-4-ен-3,17-диона (АД). Цель изобретения - упрощение способа. Культуральную жидкость, полученную микробиологическим окислением культурой Micobacterium NRRL B-3805 стерина, фильтруют. Остаток на фильтре экстрагируют смесью органического растворителя, смешивающего с водой, и воды при их соотношении 0,7 - 4 : 1. Смесь фильтруют, фильтраты объединяют и упаривают. Полученный остаток обрабатывают петролейным эфиром. Получают целевой продукт в виде кристаллического порошка белого цвета. Выход 74,5 - 91% от содержания АД в культуральной жидкости.
Изобретение относится к химии стероидов ряда андростана и касается усовершенствования способа выделения андрост-4-ен-3,17-диона (АД) формулы I 
из культуральной жидкости, полученной при микробиологическом окислении стеринов. Цель изобретения - упрощение способа. П р и м е р 1. Получение культуральной жидкости, содержащей АД. Культуру Mycobacterium NRRL B-3805 выращивают в течение 5-7 дней на следующей среде, г: Глюкоза 10,0 БВК 5,0 K2HPO4 1,0 Агар 20,0 Дистиллированная вода 1000 мл рН 7,5 Клетки смывают с агара физиологическим раствором (10 мл на 1 косяк) и 2,4 мл суспензии засевают каждую из 6 колб (емкость колбы 0,75 л), содержащую 100 мл среды следующего состава, г: Глицерин 10 Соевая мука 1,0 Лимонная кислота 2,2 Мочевина 0,5 NH4Cl 1,0 KH2PO4 0,5 MgSO4 0,5 FeCl3 0,05 CaCO3 0,15 Вода дистиллированная 1000 мл рН 6,9-7,0 Выращивание инокулята ведут на качалке при 170 об/мин и температуре 32оС. Через 48 ч роста инокулят переносят в 4 л среды следующего состава, г: Глицерин 20 Соевая мука 10 Мочевина 0,5 Лимонная кислота 2,2 NH4Cl 1,0 KH2PO4 0,5 MgSO4 0,5 FeCl3 0,05 CaCO3 0,15 Вода дистиллированная 1000 мл рН 6,9-7,0 Добавляют 0,3 л водной стерильной суспензии 22,5 г микронизированного ситостерина с добавлением 0,78 г сорбиталя С-20. Состав ситостерина, %: Кампостерин 12,7 Кампостанол 1,8 
-Ситостерин 51,8 Ситостанол 13 Трансформацию осуществляют в 10-литровом стеклянном ферментере при подаче воздуха 1 л/л/мин при работающей мешалке 800 об/мин и температуре 32оС. Через 24 ч ферментации добавляют вторую порцию стероида, равную первой. Общее количество загруженного ситостерина 45 г. Ход процесса анализируется методом ТСХ в системе хлороформ-эфир в соотношении 4:1. Время трансформации составляет 96 ч. По данным анализа получают культуральную жидкость, содержащую 12-13 г АД и 4,5-5 г стеринов. П р и м е р 2. 5 л культуральной жидкости, полученной по примеру 1 и содержащей (по данным ТСХ-анализа) 13,2 г андрост-4-ен-3,17-диона, 4,92 г ситостерина, фильтруют и фильтрат, как практически не содержащий целевого продукта (менее 1%), отбрасывают. Полученный остаток (259 г) в виде пасты (содержит 180 г воды, АД, биомассу, ситостерин и другие примеси) смешивают с 0,5 л ацетона (с учетом воды в пасте, соотношение ацетон-вода 2,5:1). Смесь фильтруют, а остаток дважды смешивают с 0,3 л смеси ацетон-вода (соотношение 2,33:1) и фильтруют. Объединенный фильтрат, содержащий АД, упаривают, остаток обрабатывают петролейным эфиром (20 мл). Получают 12,26 г АД (или 93%, считая на содержание его в культуральной жидкости) в виде кристаллического порошка белого цвета, т.пл. 165-167оС. После перекристаллизации из ацетона получают АД с выходом 79,7% в расчете на АД, содержащийся в культуральной жидкости, т.пл. 170-171оС. П р и м е р 3. Kультуральную жидкость (1,5 л), содержащую по данным ТСХ-анализа 2,87 г АД и 5,7 г стеринов, фильтруют. Полученный остаток (86 г) в виде 70%-ной влажной пасты, содержащей биомассу, АД и стерины, смешивают с 170 мл ацетона. Смесь фильтруют, осадок обрабатывают (100 мл х 2 раза) смесью ацетон-вода (4:1). Объединенный фильтрат упаривают в вакууме, выпавший осадок отфильтровывают и сушат. Получают 4,48 г технического АД, содержащего 66,37% АД, 2,5% стеринов и 2% АДД, т.е. АД выделяют из культуральной жидкости с количественным выходом. Полученный технический продукт смешивают с 14 мл петролейного эфира, осадок отфильтровывают и после высушивания перекристаллизовывают из ацетона. Получают 2,33 г АД с т.пл. 170-171оС, выход 81% от содержания его в культуральной жидкости. П р и м е р 4. 1,4 л культуральной жидкости (содержание АД 2,56 г, стеринов 5,5 г) фильтруют, полученную пасту (83 г, содержание воды 70%), как в примере 2, экстрагируют последовательно 150 мл этилового спирта (с учетом воды в пасте, соотношение спирт-вода 2,6:1), 120 мл смеси этанол-вода (4:1) и затем 100 мл смеси этанол-вода (4:1). После упаривания объединенного фильтрата получают 4,06 г технического АД (содержание АД 67,4%, стеринов 2%, АДД 1,5%), который очищают в условиях примера 3. Получают 2,03 г АД с т.пл. 169,5-171оС, выход 79% от содержания его в культуральной жидкости. П р и м е р 5. Культуральную жидкость 1,5 л (содержание АД 2,92 г, стеринов 5,8 г) фильтруют, полученную пасту (87,7 г, содержание воды 70%) экстрагируют, как указано в примере 2, последовательно 150 мл ацетонитрила и дважды 100 мл смеси ацетонитрил-вода (4:1). После упаривания объединенного фильтрата получают 3,76 г технического АД (содержание АД 77,64 %, стеринов 0,5% и АДД 2%), который очищают в условиях примера 3. Получают 2,42 г АД с т.пл. 170 
1оС, выход 83% от содержания АД в культуральной жидкости. П р и м е р 6. 1 л культуральной жидкости, содержащей 1,1 г АД и 3,2 г стеринов, фильтруют. Полученную пасту (61,5 г, содержание воды 60 мас.%) смешивают с 100 мл ацетон-вода (1:1), фильтруют. Осадок дважды обрабатывают по 200 мл смеси ацетон-вода (0,7:1). Объединенные растворы упаривают. Получают 1,12 г технического АД, содержащего 90,6% АД и 1% стеринов (по данным хромато-спектрофотометрического метода). После перекристаллизации из ацетона получают 0,82 г АД с т.пл. 170-171оС, выход 74,5% от содержания в культуральной жидкости. П р и м е р 7. A. 1 л культуральной жидкости, содержащей 2,82 г АД и 1,38 г ситостерина, фильтруют. Полученную пасту (содержание воды 70 мас. %) смешивают с 50 мл ацетона (соотношение ацетон-вода, которая содержится в пасте, 1,2:1), фильтруют, ацетон упаривают. Получают 2,07 г технического АД, содержащего 91,01% АД, 0,5% ситостерина (по данным хромато-спектрофотометрического метода). Б. Использование безводного ацетона. Безводную пасту, полученную после первичной обработки ацетоном (см. пример 7 А), обрабатывают 50 мл ацетона. Получают 1,15 г продукта, содержащего (по данным хромато-спектрофотометрического метода) АД 45,44% и ситостерина 25%. Способ позволяет избирательно извлекать АД из культуральной жидкости и значительно сократить объем растворителя, используемого для экстракции, а также позволяет исключить метод хроматографической очистки АД.
Формула изобретения
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АНДРОСТ-4-ЕН-3,17-ДИОНА из культуральной жидкости, полученной микробиологическим окислением стерина, включающий экстракцию органическим растворителем, концентрирование и кристаллизацию целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, культуральную жидкость предварительно разделяют и экстрагируют полученный осадок смесью органического растворителя, смешивающегося с водой, и воды при их соотношении 0,7 - 4 : 1.MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 23.04.1996
Номер и год публикации бюллетеня: 17-2001
Извещение опубликовано: 20.06.2001
