Способ получения @ н- и @ с-меченых 11 @ -оксистероидов андростенового ряда

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3514147/13 (22) 22.11.82 (46) 30.12.92. Бюл, N. 48 (71) Институт биоорганической химии АН

БССР (72) И,А. Беспалов, С,П. Марцев. В.Л. Чащин и А.А. Ахрем (56) Sato Н. et а!. "Arch. Btochem. and

Biophys."; 1978, v.190. N 1, р.307 — 314. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Н и .С-МЕЧЕНЫХ 11 Р - ОКСИСТЕРОИДОВ АНДРОСТЕНОВОГО РЯДА, включающий трансформацию соответствующего радиоИзобретение относится к области биохимии, конкретно к усовершенствованному способу получения радиоактивно меченых стероидов андростенового ряуа и может найти применениедля синтеза H-и С-ме14 ченых 11Р -oêcèàíäðocòåíoâ, необходимых для создания медицинских радиодиагностических наборов, Цель изобретения — повышение выхода целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем; что в способе получения Н- и С-меченых 11

З 14

Р -оксистероидов андростенового ряда, включающем трансформацию соответствующего радиоактивного 11 Р -дезоксистероида с помощью системы. содержащей адренодоксинредуктазу. адренодоксин, цитохром Р-450 и систему регенерации

НАДФ-Н, отличительной особенностью является то, что используют иммобилизованную мультиферментную систему, . ЯЛ, 1135191 А1 (st>s С 12 P 33/00: 33/06, С 07 В 59/00

l активного 11 /3-дезоксистероида с помощью системы, содержащей адренодоксинредуктазу, адренодоксин. цитохром Р-450 и систему регенерации НАДФ-Н. о т л и ч а юшийся тем. что, с целью повышения выхода целевого продукта, используют иммобилизованную мультиферментную систему, состоящую из адренодоксинредуктазы, адренодоксина и цитохрома P-450 в молярных соотношениях 2,7-3,2:6,3 — 7,9:1 и получаемую путем ковалентной иммобилизации адренодоксина на сефарозе с последующей сорбцией на адренодоксин-сефарозе цитохрома

P-450 и адренодоксинредуктазы. состоящую из адренодоксинредуктазы, адренодоксина и цитохрома P-450 в молярных соотношениях 2,7-3,2:6 — 7.9:1 и получаемую путем ковалентной иммобилизации адренодоксина на сефарозе с последующей сорбцией на адренодоксин-сефарозе цитохрома

P-450 и адренодоксинредуктазы.

Способ осуществля ют следующим образом.

Заявляемый способ включает ковалент- Q ную иммобилизацию адренодоксина и получение адренодоксин-сефарозы. Насыщение сорбента цитохромом P-450 проводили c помощью бзтч-варианта сорбции. который включает в себя инкубацию всего объема сорбента с цитохромом Р-450 и обеспечивает равномерное распределение белковых молекул во всем объеме аффинного сорбента. Бэтч-адсорбцию адренодоксинредуктазы проводили путем инкубации раствора флавопротеида с адренодоксинсефарозой, 1135191 содержащей цитохром P-450. Сорбционный способ иммобилизации адренодоксинредуктазы. и цитохрома P-450 путем взаимодействия с ковалентно иммобилизованным адренодоксином дает возможность образования биоспецифических белок.-белковых комплексов, являющихся каталитически компонентными. Таким образом, ковалентно-сорбционный способ реконструкции 11

Р-гидроксилаэной системы соединяет в себя преимущества ковалентной иммобилизации, такие как стабильность иммобилизованного фермента. с возможностью биоспецифического пространственного контакта белковых компонентов, обеспечивающего. функционирование мультиферментной системы.

При реконструкции мультиферментной системы использовано молярное соотношение адренодоксина, цитохрома P-450 и адренодоксинредуктазы, варьирующее в пределах (6,3-7.9):1:(2,7-3.2). Данное соотношение компонентов позволяет избежать черезвычайно высоких (150-кратных) молярных избытков адренодоксина, использованных в прототипе и обеспечивает более эффективное по сравнению с прототипом. использование белка.

Реконструированную таким образом мультиферментную систему использовали для ферментативной трансформации тестостероина и андростендиона, Для этого адренодоксин-сефарозу с сорбированными на ней белками набивали в колонку и через полученный колоночный реактор пропускали буферный раствор. содержащий компоненты НАДФ-Н-регенерирующей системы (НАДФ-Н, глюкозо-6-фосфат и глюкозо-6фосфат-дегидрогеназу), а также раствор Н— либо 4С-меченого тестостерона или андростендиона.

Количественное определение продуктов реакции нокаэало, что заявляемый способ получения 11 /3 -оксиандростенов позволяет значительно увеличить временную стабильность мультиферментной системы и пролонгировать работу ферментативного реактора до временных интервалов в 10-20 ч и более вместо нескольких минут согласно условиям, описанным в прототипе. Это позволяет повысить процент трансформации субстрата до 65 .

Кроме того, применение иммобилизованной ковалентно-сорбционным способом 11

)3-гидроксилазной системы делает возможным многократное использование белковых компонентов ферментативной системы, поскольку гидроксилированный продукт покидает зону реакции, и экстракция элюата, 50

Для сорбции адренодоксинредуктазы раствор с концентрацией флавопротеида 34 мкМ в 0,01 М натрий-фосфатном буфере (рН 7,4), содержащем 10 мкМ тестостерона, инкубировали 20 мин при 0 С с адренодоксин-сефарозой из расчета 10 мл раствора флавопротеида на 1 мл сорбента. Суспензию центрифугировали при 2000g х 2 мин и супернатант с несорбированным белком удаляли. вытекакйцего из колончатого реактора, органическим растворителем не приводит к денатурации белковых компонентов.

Способ отличается от прототипа тем, что в заявляемом способе вместо растворимой 11 /3-гидроксилазной системы использована. иммобилизованная ковалентно-сорбционным способом ферментативная система 11 /3-гидроксилирования, что обеспечивает высокую временную стабильность системы и получение Н- и С-меченых стероидов в количе3 34 ствах, во много раз превышающих возможность способа. описанного в прото"5 типе (таблица), а также дает возможность многократного использования иммобилизаванной ферментативной системы.

fl р и м е р 1. Для ковалентно-сорбциоННоА реконструкции мультиферментной 11

20 /3-гидроксилазной системы используют гомогенные белковые компоненты этой системы— адренодоксинредуктазу, адренодоксин и цитохром P"450, выделенные из митохондрий надпочечных желез крупного рогатого скота.

Ковалентной иммобилизацией адренодоксина íà CNBV-активированной сефарозе 4В получают аффинный сорбент — адренодоксин-сефарозу, содержащую 220-330 нмоль иммобилизованного адренодоксина на 1 мл

30 уплотненного геля.

Сорбцию цитохрома Р-450 проводили следующим образом. Раствор с концентрацией цитохрома P-450 20-30 мкМ в 0,05 натрийфосфатном буфере (рН 7,4), 35 содержащем 0,3 холата натрия,,2 M КО, 0.05% твина 20 и 20 мкМ тестостерона, разводили в 25-30 раз 0,01 М натрий-фосфатным буфером, содержащим 10 мкМ тестостерона и инкубировали 40 мин при

40 0 С с адренодоксин-сефарозой из расчета

15 мл раствора цитохрома Р-450 (10 — 15 нмоль гемопротеида) на 1 мл адренодоксинсефарозы.

Затем сорбент осаждали центрифугиро45 ванием при 2000g х 2 мин, супернатант удаляли и процедуру сорбции цитохрома повторяли еще 3-5 раз с новыми порциями раствора белка.

1135191

10

20

35

Количественную оценку сорбированных белков проводили как по убыли белков из супернэтанта инкубационной суспензии, так и после зкстракции сорбированных белков с эликвоты адренодоксин-сефарозы, Уплотненную эдренодоксин-сефарозу с сорбированными на ней флавопротеидом и цитохромом Р-450 суспендируют в 0,01 M натрий-фосфатном буфере (рН 7,4). содержащем 10 мкМ тестостерона и набивают в колонку диаметром 8 мм. Для проведения

11 ф-гидроксилазной реакции через полученный таким образом колоночный реактор пропускают фосфатный буфер, содержащий (1,2,6,7- Н)-тестостерон и комз поненты НАДФ-Н-регенерирующей системы: НАДФ-Н, глюкозо-6-фосфат и глюкоза-6-фосфатдегидрогеназу. Скорость тока раствора 1,5 мл/ч, температура — 20 С.

Элюат собирают порциями по 0.75 мл с помощью коллектора фракций и во фракциях количественно определяют соотношение субстрата и продукта реакции. Для этого стероиды зкстрагируют 6 мл зтилэцетэта, упаривают при температуре не выше 45 С и разделяют с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках с закрепленным слоем силикагеля, используя в качестве злюента систему бензол:ацетон 13:7. Процент трансформации субстрата определяли по формуле: 100-.В/(А+ В + С), где А — радиоактивность в пятне субстрата реакции, В— радиоактивность в пятне основного продукта реакции, С вЂ” радиоактивность в пятнах побочных продуктов реакции.

Колоночный реактор, использованный для трансформации зН-.меченого тестостерона, содержал: 0,8 мл уплотненной адренодок©инсефарозы (220 нмоль иммобилизованного эдренодоксина), 90 нмоль адренодоксин-редуктазы и 28 нмоль цитохрома P-450. Элюционный раствор содержал: 0,01 М натрий-фосфатный буфер,(рН 7,4), 100 мкМ тестостерон с добавкой зН-тестостерона в концентрации 1,8 мкКи/мл, 3 мМ НАДФ-Н, 5 мМ глюкозо-6-фосфэт и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу в количестве 2,5 единицы на 1 мл раствора.

Полученный целевой продукт — Н-мечез ный 11 Р-окситестостерон очищен с помощью тонкослойной хроматографии и идентифицирован на основании сравнения хроматографических подвижностей со стандартом 11 Р-окситестостерона в различных системах растворителей. Радиохимическая чистота полученного продукта была не ниже

94

Пример 2. Пример иллюстрирует ферментативную трансформацию Н-мечез ного андростендиона, Реконструкцию мультиферментной системы и ферментатив ый цикл проводили, как описано в примера 1, используя в качестве субстрата реакции андростендион с добавкой Н-меченого а дростендиона в концентрации 1,7 мкКи/мл, Колоночн ый реактор в атом случае содержал

0,8 мл уплотненной адренодоксинсефарозы (220 нмоль иммобилизованного адренодоксина), 94 нмоль адренодоксинредуктазы, 28 нмоль цитохрома P-450, радиохимическая чистота продукта реакции — Н-меченого 11 Роксиандростендиона, идентифицированного на основании сравнения хроматографических подвижностей со стандартом 11 Р-оксиандростендиона в различных системах растворителей, составляла 95 и более.

Пример 3. Ферментативная трансформация С-меченого андростендиона.

Приготовление колоночного раствора и цикл ферментативной трансформации проводили согласно примеру 1. В качестве субстрата реакции использован андростендион с добавкой (4- С)-андрост14

4-ен-3,17-диона в концентрации 0,1 мкКи/мл. Колоночный реактор содержал 0,8 мл адренодоксин-.сефарозы (220 нмоль иммобилизованного адренодоксина), 88 нмоль адренодоксинредуктазы и 31 нмоль цитохрома Р-450. Радиохимическая чистота продукта реакции, идентифицированного на основании сравнения его хроматографических подвижностей с подвижностями стандарта 11/ -оксиандростендиона в нескольких системах растворителей. была не менее 95%.

Анализ интегральных параметров каталитической эффективности иммобилизованной 11 j3 -гидроксилазной системы, представленных в таблице, демонстрирует преимущества заявляемого способа получения 11 j3-оксиандростенов по сравнению с прототипом. Реакция 11/ -гидроксилирования в способе. описанном в прототипе, длится несколько минут. Авторы работы, взятой за прототип, не приводят параметров временной стабильности ферментативной cèñòåìû. однако известно. что ферментативная реакция, проводимая при

37 С, прекращается в течение нескольких минут из-за быстрой инактивэции фермента. Так, растворимая мультиферментная система 11 j3-гидроксилирования теряет около

30 активности за 8 мин функционирования при 37 С.

Активность 11/3-гидроксилирования андростендиона иммобилизованной системой остается практически неизменной в течение

20 ч. Стабильность иммобилизованной фер1135191

1 - за 20 ч потеря ферментативной активности составила 15 .

2 - за 20 ч потеря ферментативной активности составила 18, 3 - в расчете на 2 мин проведения ферментативной реакции, ментативной системы, охарактеризованная по времени потери системой 30 активности, в 80 и более раз выше, чем стабильность растворимой системы.

Благодаря высокой стабильности иммобилизованной 11,В-гидроксилазной системы возможно проведение длительных циклов трансформации и получение миллиграмовых количеств стероидных продуктов.

Несмотря на то, что активность растворимой системы, рассчитанная на единицу содержания цитохрома Р-450, выше чем иммобилизованной, применение ее для получения 11/3-оксиандростенов ограничено из-за большого расхода белковых компонентов и невозможности их повторного использования. Так. для получения 2 мкмоль 1 1/3 -окситестостерона при использовании растворимой ферментативной системы и работе в кинетическом концентрационном и временном диапазо нах параметров реакции, потребовалось бы

33 нмоль цитохрома P-450, т.е. примерно столько же, сколько взято для ферментативной трансформации андростенов иммоби"1(оличество белковых нентов в реконструир.

"системе - адренодо дуктаза: адренодокси ром Р-450 (нмоль) Время потери ферме ной системой 30 акт

Выход 1 1Р-оксистер полный цикл трансфо общее количест продукта количество про расчете на 1 нм цитохрома P-45 (н моль/н моль) Суммарный процент т ма ии с бст ата лизованной системой. Однако необходимое количество адренодоксина должно было бы составить 4,5 мкмоль, т.е. в 20 раз больше, чем при использовании иммобилизованной

5 системы, При этом расход адренодоксина был бы выше, чем выход целевого продукта. а повторное использование белковых компонентов невозможно, В то же время использование ковалентно-иммббилизованного

10 андренодоксина открывает возможность ренатурации этого белка, инактивированного в ходе стероидгидроксилазной реакции.

Высокие молярные избытки адренодок15 сина над цитохромом P-450 (150-кратные) использованы в прототипе для достижения максимальной каталитической активности в течение очень короткого промежутка времени.

Использование 11Р-гидроксилазной системы, 20 реконструированной ковалентно-сорбционным способом, кроме указанных выше преимуществ в стабильности дает возможность резки снизить избытки адренодоксина над цитохромом до 6 — 8-кратных при сохране25 нии каталитической активности системы.