Способ очистки противостолбнячного препарата иммуноглобулина человека

 

Изобретение относится к медицине специфических иммунных препаратов, получаемых из плазмы донорской крови человека. Цель изобретения - расширение спектра действия противостолбнячного препарата иммуноглобулина человека за счет внуривенного введения. Иммуноглобулин противостолбнячный для внутримышечного введения обрабатывают лиофилизированным пепсином для снижения антикомплементарной активности с последующей адсорбцией остаточного пепсина гидроокисью аммония и коррекции pH целевого продукта до назначений 6 и 9. 1 табл.

Изобретение относится к медицине и касается специфических иммунных препаратов, получаемых из плазмы донорской крови человека. Цель изобретения - расширение спектра действия противостолбнячного препарата иммуноглобулина человека за счет внутривенного введения. В качестве исходного материала используют плазму иммунных доноров, полученную методом плазма фереза. Усредненный титр противостолбнячных антител в котловой смеси был 16 МЕ/мл в реакции пассивной гемагглютинации и 8 МЕ/мл в реакции нейтрализации токсина на белых мышах. Объем плазмы составляет 100 л. Фракционирование ведут по схеме, изложенной в Типовом комплексном регламенте производства белковых препаратов плазмы донорской крови. На первой стадии фракционирования к плазме при постоянном перемешивании добавляют 53% -ный раствор этанола с температурой -20^oC в количестве 18 л. Температуру плазмы снижают от 0 до -3^oC к концу осаждения. Раствор центрифугируют и получают осадок фибриногена в количестве 1 кг и центрифугат в объеме 88 л. К центрифугату с температурой -2^oC добавляют 53,7 л этанола, охлажденного до -20^oC. Полученный раствор перемешивают и центрифугируют. Центрифугат поступает на дальнейшую обработку с целью получения альбумина, а осадок II+III (5,5 кг), содержащий иммуноглобулин, суспендируют в 40,25 л 0,15 М раствора хлорида натрия. Температуру суспензии понижают до -8^oC с одновременным добавлением 41,2 л охлажденного до -20^oC этанола. После тщательного перемешивания раствор центрифугируют и получают 5,4 кг отмытого осадка фракции II+III. Далее осадок суспендируют в 5,4 л 0,15 М раствора хлорида натрия и 36,45 л дистиллированной воды. К полученной суспензии добавляют ацетатный буфер и устанавливают рН раствора 5,1, после чего добавляют 48 л 26% -ного этилового спирта, охлажденного до -15^oC, снижая температуру смеси до -4^oC. После центрифугирования получают осадок (2,5 кг) бета-глобулина и липидов, который не используют, а центрифугат подвергают осветляющей фильтрации через асбестовые пластины. В фильтрате (90 л) устанавливают рН 6,95 с помощью 300 мл 1 М раствора углекислого натрия, затем добавляют охлажденный до -20^oC 96% -ный этиловый спирт в количестве 14,4 л. Температуру раствора понижают до -9^oС, перемешивают и центрифугируют. Полученный осадок противостолбнячного иммуноглобулина составляет 2 кг. Осадок суспендируют в 3,0 л 0,15 М раствора хлорида натрия с 2% гликокола, фильтруют через бумажную мезгу и разливают по 200 мл во флаконы емкостью 500 мл. Получают 25 флаконов. Раствор иммуноглобулина замораживают при температуре не выше -45^oC и закаливают при этой же температуре 20 ч. Сублимационную сушку проводят на аппарате КС-30 по графику сушки иммуноглобулинов. Лиофилизированный порошок извлекают из флаконов (500 г) и растворяют в 2 л апирогенной дистиллированной воды, устанавливая концентрацию белка в растворе 14,84% . Коррекцию рН осуществляют 0,1 н и раствором соляной кислоты, доводя до 5,05, на что потребовалось 1,5 л кислоты. П р и м е р. К иммуноглобулину противостолбнячному, полученному по методу Кона, с рН исходного продукта 3,2-4,0, прибавляют на 100 г белка лиофилизированный пепсин ТE-09-10-229-7,4 с целью снижения антикомплементарной активности. Проводят стерилизующую фильтрацию через пластины Миллипор и выдерживают бутыль с фильтратом при 37^oC в течение 18 ч. После протеолиза остаточный пепсин адсорбируют гелем гидроокиси алюминия. Образовавшийся нерастворимый комплекс "фермент - гидроокись алюминия" отфильтровывают на бумажной мезге. В фильтрате устанавливают рН 6,9 0,1 н. раствором гидрооксида натрия (1000 мл). Раствор иммуноглобулина стерилизуют и оставляют для формирования осадка балластных белков при 5^oC в течение 30 сут. Осадок отделяют центрифугированием при 6000 об/мин в течение 1 ч. Полученный центрифугат фильтруют через стерилизующие пластины Миллипор и разливают во флаконы по 25 мл. Получено 120 флаконов. Характеристика готового препарата: прозрачная бесцветная жидкость; рН 7,1; содержание белка 4,5 г/л; препарат электрофоретически однороден; антикомплементарная активность; 25 мг белка не связывают 2СН₅₀; титр противостолбнячных антител 35 МЕ/мл; стерилен; апирогенен, не токсичен, в препарате отсутствует антиген гепатита В и антитела к ВИЧ. В таблице приведена сравнительная характеристика препарата "Иммуноглобулин человека противостолбнячный, пригодный для внутривенного введения" и прототипа - "Иммуноглобулин человека противостолбнячного" для внутримышечного введения. Как видно из приведенных в таблице аналитических данных, предлагаемый препарат отличает от прототипа сниженная в 500-4000 раз антикомплементарная активность, что дает возможность вводить его внутривенно в больших объемах, достигая быстрого лечебного эффекта. (56) Технические условия 42.14.168-80 "Иммуноглобулин противостолбнячный".

Формула изобретения

СПОСОБ ОЧИСТКИ ПРОТИВОСТОЛБНЯЧНОГО ПРЕПАРАТА ИММУНОГЛОБУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, отличающийся тем, что, с целью расширения спектра действия за счет внутривенного введения, препарат противостолбнячного иммуноглобулина обрабатывают лиофилизированным пепсином в концентрации 30 - 40 мг на 100 г белка в течение 18 ч при 37^oС при pH исходного продукта 3,2 - 4,0 с последующей адсорбцией остаточного пепсина гидроокисью алюминия и корреляции pH целевого подукта до 6,9.

РИСУНКИ

Рисунок 1