Штамм перевиваемых клеток почки новорожденного кролика для производства и контроля медицинских вирусных препаратов
Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано в медицинской вирусологии. Перевиваемый штамм клеток ПНК-86 обладает стабильными морфо-физиологическими характеристиками и чувствительностью к вирусу простого герпеса, аденовирусу типа 7 и к вирусу парагриппа 1-3 типов. Клеточный штамм, охарактеризованный в количестве 100 ампул с содержанием 2-3 млн клеток в каждой ампуле, хранится в низкотемпературном (-196)°С. Республиканском банке-музее клеточных культур на базе СНИИВИ, являющемся базовым учреждением Всесоюзной коллекции клеточных культур.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (<11)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ ПРИ ГКНТ СССР (21) 4459837/30 -13 (22) 01.06.88 (l6) 15,12.90. Г)юп. !(1 46 (71) Свердловский научflo-»с след она†тс»вский институт вирусиых»вфекций (72) Г.Г.Колеси»кова, С.И.Раскатова, Н.П.Гли»»ских, Н.A.l!ìer!ål«a и О.Л.Hefe(<,oI«a (53) 578.085. 23 (088.8) (56 » Анджа <»аридзе О . Г. ». др . Кул ьтура ткани в вирус ологическ»х исследо. ваниях. И., 1962, с ° 81. Соll ifan И. К, Rapid 1)еtection of herpes sir»pbx virus in cl inical specimens with hunan ег1«гуоп ic lung f ibrobl oat anñl pr irfary r lbb it Kidлеу аll cultyres. — J.C! in.llicroЬ iol, 1984, 19, 4, 563-565. 1!зобретение относится к области биологии и медицины и может быть ис— пол ьзовано в в»русологш» . Целью изобретения является получение нового штамма, перевиваемого клеток почки новор ожде»»пог о кролика, чувствительного к вирусам простого гернеса и парагриппа 1-3 типов и аденовирусу типа 7. !!та»»м г(е»»с«»п»рован ВСКК (СХ!») под »амером 27. Авторыы на звали шта мм ПИК-86 . Иорфологическ»»е призна ки . ! »1тамм пер ев» ва емых кд ет и к lp едставляет плот»»ый молоди 2 (54) ГИТТЛИ! ПЕРГВИВАЕ!
НОВОРО<ЩЕННОГО КРОЛИКА ДЛЯ ПРОИЗВОЛ- . СТВЛ 1! КОНТРОЛЯ 1!ЕЛИЦИНСКИХ ВИРУСНЫХ ПРЕПЛРАТОВ (5 7) Из обр ете пи е относится к меди цине и биологии и может быть использоl3aно в медицинской вирусологии. Пере— виваемый штамм клеток ПНК-86 облада-. ет стабильными морфо-физиологически»»» характеристиками и чувствительностью к вирусу простого герпеса, аденовирусу типа 7 и к вирусу парагриппа 1-3 типов. Кпеточпый штамм, охарактеризова»»ный в количестве 100 ампул с содержаиием 2-3 мпн клеток в каждой ампуле, хранится в иизкотемо пературном (-196) С Республиканском банке-музее кпеточпых культур на базе СШП1ВИ, являю»(емся базон»»м учреж— пением Всесоюзной коллекции клеточных культур . турой. Цитоплазма клеток < ветлая с Cb мелкой зернистостью. Ядра округлой формы, содержащие по 2-6 ядрышек ° С 4 Иитотическая активность клеток на 4ь 25 пассаже составляет 30-347 иа 2 сут- (,ф ки роста. Иодальннй класс слабо выражен ?3 клеток, содержит 66 хромосом. Число хромосо»» в кар»»от»пе ва— рь»рует от 41 до 85. фи виол огичес. к»»с пр»»з иа к» . В Клетки снимают со стек»»a 0,027дым раствсром Версена. При ffffnerlfpo ва»»» обр;» з уетс я o!(I«1»1 o! I I»;»!» f«:«вес ь клеток. !<(из»»есfl 1613487 регунярн))х пересенов на свежую питая .льную среду, состоящую из среды 199-45, среды Игла-457,, 10 натинной сыворотки молодняка крупного рогатогo скота и антибиотиков (пенициллин 100 ед /мл и с тр епт оми ци на 50 ед /мл) р среды 7, 2-7,4 . lаст<>та пересенон через 4 дня, к< эф<<>ициент пер ес ена 1: 3-1-4 . 10 I! р и м е р. Птамм перенинаемых l ")еток получают из почки новорожден-, ного кролика. Первичную культуру полу«)>ют методом дезагрегации кусочк<;II ор а но О, 25 .-ным раствором трипси на н т<. че><ие 10 ч инкубации н холодильнике ><ри 4 С. Раствор трипсина сли— лают, а кусочки ткани заливают средой llгла и 199 в равных соотношениях лля суспендирования: в первую порцию >< одну колбу, доводят до концентрапи)t 400-500 тыс.кл/мп добавляют 1О н,<тинный бычьей сыворотки и культиHltpуют до появления MoHo<.JIQR клеток при 37 С со сменой среды на 2 сутки роста . Первичная культура формир ует л<онослой на 4 — 5 сутки роста полимор— <)>«b»tII клетками с преобладанием фибробластоподобных с зернистой цитоппазмой. На 4-5 пассаже клетки приобретают более четкие границы и выраженную цитоархитектонику, а культура приобретает стабильный характер 35 роста . Пассирование осуществляют «ерез 3-4 суток в соотношении 1-2. Начиная с 25-27 пассажа на фоне фибробластоподобных появляются клетки эпителиеподобного типа с крупны- 40 ми ядрами овальной или округлой формы, содержащие от 2 до 6 ядрышек. К 29-30 пассажу эпителиеподобные клетки становятся преобладающими. Кратность прироста клеток на 3-4 сутки роста 30 пассажа соответствует 4,55,0. На 8 пассаже до 827 популяции составляют клетки с дипплоидным набором хромосом. В процессе культивирования происходит увеличение числа хромосом в клетках. На 25 пассаже число хромосом в клетках варьировало от 41 до 85. Модальный класс пред55 с та нле н клет ками с 66 хр омос омами и соответствует 237.. Более 507. исследованных мета<)>аз содержит от 66 до 78 хр омосом., >)я пр< норки шпет< к ПНЕ-86 на на t! t Контроль присутстния микопла зм пр<>водят с использованием О, 37 нолужидкого агара на триптическом переваре сердца крупного рогатого скота, методом анторадиографии по I)I-тими— дину. Клетки ПНК-86 заложс ны и фоцц низкотемпературного банка-музея клето«ных культур СН)1ИВИ на различных пассажньlx уровнях 6, 10, 15, 20, 26. Коллекционный номер культуры по коллекции С11ИИВИ 230/86. Режим заморажина ния: для замораживания н отбирают и прос матри нают под микроскопом монослоиные культуры клеток с четкой структурой. Клетки с нимают с о стекла, но.<действуя О, 027 раствором Версена. Взвесь разливают по ампулам н конценграции 2,0-2,5 м«н н мл. Среда криоконсерва)п!и для клеток ПНК-86 состоит из среды Игла 407,, среды 199 407, сын >ротки молодняка крупного рогатогo скота 102, лицерина х/ч 107. и антибиотиков (пенициллин 100 ед/мл и стрептомицин 100 мкг/мл) . Запаянные ампулы выдеркивают н рефрижера rope при 4-6 С в течение 1-2 ч, затем замораживают в аппарате АХК-4 со скоростью 0,5 град/мин от О до -20 С,4 град/мин от -20 до — 40 С, 10 град/мин от -40 <> до -80 С с последующим погружением в сосуды Дьюара (типа АСД-50) с жидким азотом при — 196ОС. Режим восстановления: ампулы с замороженной клеточной взвесью извлекают из сосуда Дьюара и помещают в водяную баню при 40 С для оттаивао ния. Размороженную суспенэию клеток переносят из ампул в матрасы с небольшим количеством ростовой среды, перемешивают, производят подсчет живых клеток, доводят средой роста концентрацию клеток до посевной (100" 150 тыс/мл) и помещают в термостат при 37 С. После 24 ч роста проводят смену среды роста для удале16 1348 7 Эти данные свидетельстг уют о том, что штамм клеток ПНК--86 может быть Формула изобретения !
Составитель И.Тареева Редактор О. Спесивых Техрец И.Дидык Корректор И.Эрдейи Наказ 3867 Тираж 487 Подпис но е ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ CCCP 113035, !1оскнл, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Произнодсч ненно-издательский комбинат "Патент", r.Óí<ãîðoä, ул. Гагарина, 101 ния криозлщитного вещестна (глицерина) . !!онослой формируется на 4-. 5 сутки роста. Использование штамма: анализ чувствительности клеток ПНЕ-86 показал, что вирус простого герпесл 1 типа штамм Л2 размножается н клетках, вызывая дегенерацию при пер личном заражении через 48 ч и при пассировании через 24 ч после заражения. Показатели инфекционной активности ука— занного вируса составляют 3,0-4,0 ед 1g ТПД ., /мп, При иммунофлуорес центном исследовании клеток ПНК-86 на 24-30 пассажных уровнях через 24 ч после заражения B«ч нляют наличие вирус оспе цифическог<; антегена в ядрах >0-55,. кле ток. Являясь ныс окочунст вител ьной культурой к нирусу простого герпеса, ПНК-86 широко используют для получе— ния опытных серий люминесцирующих иммуноглоб ули нон к вирусу пр ос тог о герпеса . ! !тамм перениваемых клеток ПИК-86 отличается чунстнительностьн к лденонирусу типа 7. Илксимлльные титры накопления лденовируса н культуре 2830 пассажей составляет 4,5-5,0 ед ТПД<>/ип через 96 ч после злрлжения. использован для получения соответствующих диагностических препаратов, 5 При сравнительном анализе чувствительности клеток ПНК-86 к вирусу парагриппа 1, 2 и 3 типов устанавливают, что при инфицировании клеток вирусом ПГ 3 типа отмечают накопление гемагглютининов в титре 1:" на 10 сутки ir в более поздние сроки, в то же время наступает и дегенерация клеток. Вирус ПГ 1 типа размножается н клетках с проявлением дегенерации на 12-13 сутки, с накоплением гемагглютининов на 9 сутки в низких титрах. Клетки ПНК-86 чунстнительны и к вирусу ПГ 2 типа без накопления 20 гемлгглютининов, но с проявлением признаков дегенерации на 12-14 сутки. Чувствительность клеток ПНК-86 позволяет рекомендовать их для возможного использования н производстве 25 диагностических препаратов.
