Способ выявления цибридов среди растений-регенерантов, полученных при соматической гибридизации

 

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к диагностическим методам анализа растений,и может применяться в культуре растительных клеток , тканей и протопластов для идентификации цибридов или гибридов различной асимметрии с чужеродной цитоплазмой . Целью изобретения является упрощение технологии выявления цибридов и сокращение длительности процесса . Способ состоит в том, что выделяют протопласты родительских форм и регенерантов, определяют их фотосинтетическую активность и по ней иден- . тифицирзтот цибриды. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ ЕСПУВЛИН

„„Я0„„163О7О9

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ с

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ, ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4655694/13 (22) 27.02. 89 (46) 28.02.91. Бюл. и 8 (71) Отделение клеточной биологии и инженерии Инстйтута .ботаники

АН УССР (72) В.М.Самойлов, В.A.Сидоров, ф.НД1евченко, А.M.Ñàìîéëoâ, .Ц.Глагоцкая и Ю.Ю.Глеба

53}. 578.085.23 (088.8)

56) Сидоров В.А. и др. Соматическая у ибридизация пасленовых. Киев: Наукова Думка, 1985, с,98,. ф54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ЦИБРИДОВ.СРЕД4 .

РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ,ПОЛУЧЕННЫХ ПРИ

СОМАТИЧЕСКОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ

Изобретение относится к биотехно.логии, а именно к диагностическим методам анализа растений, и может .применяться в культуре растительных клеток, тканей и протопластов для идентификации .цибридов или ибридов ,.различной асимметрии с чужеродной цитоплазмой.

Цель изобретения — упрощение технологии выявления цибридов и сокращение длительности процесса.

Способ состоит в том, что у родительских форм и растений-регенерантов, полученных при соматической гибридизации, выделяют протопласты, измеряют их фотосинтетическую активность и по ней идентифицируют цибриды.

Растения выращивают на безгормональной.среде Мурасиге-Скуга при 24.25 С и освещенности 2000 лк. (У1)5 А 01 Н 4/00, С 12 N 5/00

2 (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к диагностическим методам анализа растений,и может применяться в культуре растительных клеток, тканей и протопластов для идентификации цибридов или гибридов раз" личйой асимметрии с чужеродной цитоплазмой, Целью изобретения является упрощение технологии выявления цибри . дов и сокращение длительности процесса. Способ состоит в том, что выделяют протопласты родительских форм и регеиерантов, определяют их фотосинтетическую активность и по ней иден- . тифицируют цибриды, 1 табл.

Пример 1. Источником прото,пластов берут асептически выращиваемые растения сорта "Зарево". Листья нарезают узкими полосами шириной 12 мм и переносят на поверхность ферментного раствора. Для ферментацйи используют раствор, содержащий 1Х

Cellulisine, 0,5Ы Macerase, 0,5 М . сахарозу и 5 мМ СаС1, рН 5,6. Листья инкубируют 14-16 ч в темноте о при 28 С. Протопласты фильтруют. через сито с диаметром пор 60-100 мкм. фильтрат центрифугируют 2-3. мин при

150 д. Протопласты, плавающие на поверхности раствора, собирают пастеровской пипеткой и переносят в другую пробирку.. К суспензии протопластов (О 5-1 мл) при перемешивании добавляют 8-10 мл среды У 5. (NaCl9 г/л; CaG1 13,9 r/л; KCl - 0,8 г/л; глюкоза 1 г/л; рН 5,7). Центрифуги

1630709 руют 3 мин при 80-100 д. Надосадочную жидкость удаляют. Процедуру повторяют дважды.

Пример 2. Источником протопластов берут асептически выращиваемые растения дикого вида картофеля

Solanum pinnatisectum. Протопласты выделяют указанным способом.

Пример 3 ° Источником прото.пластов служат асептически выращива1. емые растения-регенеранты, полученные, в результате соматической гибридиза- I ции протопластов сорта "Зарево" и протопластов дикого вида S.pinnatisectum. Èíòåíñèâíîñòü флюоресценции протопластов определяют на флюориметре. Плотность суспензий протоплас- тов уравнивают визуально по интенсивности окраски, добавляя среду M 5.

Конечный объем суспензий 50-70 мп.

Суспензию протопластов в объеме 5 мл- сорта картофеля "Зарево" помещают в кювету флюориметра и возбуждают флюоресценцию хлорофилла светом в широкой области спектра (400-640 нм).

Снимают показания интенсивности флюЪ. оресценции хлорофилла (Фл) протопластов. Затем в кювету добавляют раствор, содержащий гербицид симазин, -.блокирующий фотосинтез. Конечная кон-

-центрация симазина в кювете lx"

y,i0 моль/л, Снимают показания. По разнице показаний интенсивности флю- . оресценции хлорофилла протопластов до (Фл) и после добавления симазина (Фл + симаз) определяют относитель ную интенсивность флюоресценции (Иф) по формуле (Фл + симаз) - Фл

Фл + симаз

Измерения проводят в 3-4 кратной повторностях. Результаты измерений заносят в таблицу. Интенсивность флю- оресценции протопластов S.pinnatisectum измеряют указанным способом.

Затем измеряют интенсивность флюоресI изобретения

Способ выявления цибридов среди растений-регенерантов, полученных при соматической гибридизации, вклю40 чающий идентификацию хлоропластов, характерных для растений-доноров, о т л и ч а ю .шийся тем, что, с целью упрощения технологии выявле-; ния цибридов и сокращения длительнос

45 ти пРоцесса, для идентификации выделяют протопласты родительских форм и растений-регенерантов и проводят измерение интенсивности флюоресценции их хлорофилла, по которой ведут отбор цибридов, 1 ъ ценции хлорофилла протопластов растений-регенерантов., Цибриды-растения с хлоропластами дикого вида S.pinnatisectum имеют интенсивность флюоресценции, сходную с протопластами дикого вида, и превышают интенсивность флюоресценции протопластов сорта "Зарево". По раз-, нице в интенсивности флюоресценции протопластов родительских форм растений и регенерантов отбирают цибридные линии.

Б табл. 1 приведены данные интенсивности фотосинтеза родительских форм растений и отобранных цибридов ,линии Sp 10, Sp 13, Sp 21.

Для контроля выявленные с помощью . указанного способа цибриды линий:

Sp 10, Sp 13, Sp 2 t, проверяют путем рестриктного анализа их хл ДНК, Из сравнения спектров хл ДНК можно отметить рестриктные спектры хл ДНК

Sp 10, Sp 13, Sp 21.идентичные спект25 рам хл ДНК S.pinnatisectum, что свидетельствует о цибридной природе отобранных линий.

Таким образом, предлагаемый способ является достоверным способом выявле3р ния цибридов . Способ позволяет упростить технологию выявления цибридов среди растений-регенерантов, полученных при соматической..гибридизации, сократить, затраты труда, времени и средств.

35 формула

1630709

Параметры Фл Фл+симаз растений

Иф

Scape

4Ю

Х =

Sat

Х =

S.р. 10

Х

S.p. 13

Х =

, Seep °

Составитель В.Демкии

Техред Y.. Иоргентал

Корректор Т.Палий

Редактор С.Лисина

I Заказ 505 Тираж 362 Подпиеное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретенйям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина 101

238

253

249

243

246 X

278

269

258

249

264 Х .271

303

307 Х

248

268

259

260 X

259

258

272

= 261 X

292

= 392

308

292

271

293

376

426

448

441

= 423

329

331

= 338

356

352

351

0,165

0,134

0,156

0,176

0,158+0,048

0,097

0,103

О, 116

0,081

= 0,099+0,007

0,279

0,289

0,263

0,263

= 0,274+0,006

0,217

0,200

0,195

0,218

= 0,207+0,006

0,272

0,261

0,267

0,223

= 0,256+0,011