Способ культивирования хрящевых фрагментов

 

Изобретение относится к клеточной биологии и может быть использовано в медицинской и ветеринарной практике. Цель изобретения - повышение пролиферативной активности и улучшение дифференцировки клеток. Способ заключается в том, что хрящевые фрагменты культивируют на подложке из деминерализованной кости в жидкой питательной среде при 36°С в атмосфере воздуха с добавлением 5% CO<SB POS="POST">2</SB> в течение 15 сут со сменой среды. В процессе культивирования через 10 сут наблюдается аппозиционный рост хряща, а через 15 сут культивирования - интерстициальный рост и активное деление молодых клеток.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 5/00

ГОСУДАР СТВ Е ННЫ И КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4652813/30-13 (22) 19,01.89 (46) 07.12.90. Бюл, ¹ 45 (71) Украинский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии (72) Г.Б. Герус и Н.В. Дедух (53) 578.085.23(088,8)

{56) Silbermann M. et ai, in vitro

transformation of chondropgenitor сеИв into

osteoblasts and the formation of new

membrane bone, — J. Anatomic Record,1983, 206, ¹4,,р. 373 — 383, (54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ХРЯЩЕВЫХ ФРАГМЕНТОВ

Изобретение относится к области клеточной биологии и может быть использовано в медицинской и ветеринарной практике, Цель изобретения — повышение пролиферативной активности и улучшение дифференцировки клеток, Пример 1, Подложки из костной ткани животных готовят следующим образом, Отбирают бедренные кости у 10-дневных цыплят и у 4 — 6-месячных крыс, помещают их в декальцинатор, состоящий из 20%-ного нитрата натрия и муравьиной кислоты в равных частях, После деминерализации бедренных костей у них отсекают эпифизы, удаляют костный мозг, очищают от мышечных волокон, после чего трижды промывают дистиллированной водой (по

20 мин), опускают в 96-градусный спирт на

5 ч для обезжиривания, После этого трижды промывают вдистиллированной воде(по

30 мин), два раза в растворе Хенкса с антибиотиками (по 20 мин), после чего переносят в питательную среду 199, содержащую 10%

ÄÄ5UÄÄ 1611931 А1 (57) Изобретение относится к клеточной биологии и может быть использовано в медицинской и ветеринарной практике. Цель изобретения — повышение пролиферативной активности и улучшение дифференцировки клеток. Способ заключается в том, что хрящевые фрагменты культивируют на подложке из деминерализованной кости в жидкой питательной среде при 36 С в атмосфере воздуха с добавлением 5% СО2 в течение 15 сут со сменой среды. В процессе культивирования через 10 сут наблюдается аппозиционный рост хряща, а через 15 сут культивирования — интерстициальный рост и активное деление молодых клеток, глюкозы, В этой питательной среде и хранятся костные подложки при -4 С.

Пример 2. Хращевую ткань, полученную у 10-ти дневных крысят с головок бедренных костей, коленных суставов, межпозвоночных дисков тщательно отмывают в двух порциях среды 199 с антибиотиками, Осторожно отсекают лезвием бритвы прилежащие мышечные волокна, связки, Хрящ, взятый с головок бедренной кости, рассекают лезвием на четыре части, Межпозвоночные хрящевые диски и хрящевая ткань каленного сустава не рассекается, а высаживается в костное ложе подложек, получен н ых от 4-месячных крыс, таким образом, чтобы хрящевая ткань плотно прилегала к костному основание. Подложки с хрящевыми фрагментами укладывают в чашки Петри, где находится питательная среда 199 с добавлением 20% — ной нормальной инактивированной сыворотки крупного рогатого скота. Культивирование проводят при 36 С в атмосфере воздуха с

1611931

Формула изобретения

Составитель А.Романченко

Редактор Н.Бобкова Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор А,Обручар

Заказ 3813 Тираж 484 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 обавлением 5 g, C0z в течение 15 дней со меной среды каждые 48 ч. В течение перЙых двух дней хрящевая ткань сохраняет свою первоначальную структуру. Через пять суток культивирования наблюдается увеличение числа хондробластических клеток.

Через десять суток культивирования на блюдается аппозиционный рост хряща, неифференцированные клетки на поверхности хряща пролиферируют и дифференцируются в молодые хрящевые клетки, Через 15 сут культивирования наблюдается интерстициальный рост хряща, молодые хрящевые клетки делятся, образуя

, клеточное гнездо, состоящее иэ двух или четырех клеток, т.е. хрящевые клетки клеточных гнезд представляют собой клоны,,так как они являются потомством одной ис,,ходной хрящевой клетки.

Пример 3, Бедренную кость с хря, щевыми эпифизами выделяют у 18-дневных куриных эмбрионов, отсекают лезвием бритвы прилежащие мыщечные волокна, связки, отмывают в двух порциях среды 199 с антибиотиками и укладывают в декальци, нированные косточки-подложки 10-дневных цыплят. Культивирование проводят как .,описано в примере 1 в течение 15 сут, Мор; фологические особенности культивируемой костной ткани определяют на срезах,окрашенных гематоксилинэозином.l Костная ткань после культивирования сохраняет свою цитоморфологическую характеристи ку. Остеобласты располагаются на поверх, ности кости и представляют собой крупные клетки с одиночным ядром, цитоплазма резко базофильна. У эпифиэарных пластинок наблюдается интерстициальный рост хряща.

При культивировании эксплантатов мыщелков нижней. челюсти 19 — 20-дневных зародышей мышей, содержащие чистый хрящ, на миллипоровых фильтрах в модифицированной среде Игла в течение 10 дней эффективность культивирования по

5 известному способу довольно низка. Так в течение первых 2 сут ткань хряща сохраняет свою первоначальную структуру. Через пять суток культивирования хондробластические клетки исчезают и весь хрящ заполня10 ют гипертрофированные хондроциты, а меэенхимальн ые клетки дифференцируются в остеобласти, которые продуцируют остеоид, По поедлагаемому способу, начиная с пятого дня культивирования, наблюдается

15 увеличение числа хондробластических клеток и к 10-му дню наблюдается аппозиционный рост хряща с пролиферацией и дифференцировкой недифференцированных клеток, а к 15-му дню культивирования

20 наблюдается интерстициальный рост хряща.

Добавочное влияние на индукцию хондрогенеэа в культуре клеток может играть морфогенетический белок, а также остеоин25 дуктивный фактор, содержащийся в деминерализованной кости, играющей роль в остеобразований in vitro.

Использование способа позволяет с высокой эффективностью получить рост клеток

30 в хрящевых эксплантатах, которые могут быть использованы в медицине и ветеринарии для регенерации суставных хрящей, Способ культивирования хрящевых фрагментов, включающий выращивание их на подложках в жидкой питательной среде, отличающийся тем, что, с целью

40 повышения пролиферативной активности и улучшения дифференцировки клеток, в качестве подложки используют деминерализованную костную ткань животных.