Штамм бактерий sеrrатiа маrсеsсеns, используемый для трансформации днк с геном устойчивости к ампициллину

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и представляет собой новый штамм бактерий SERRATIA MARCESCENS ВКПМ В-3858 (N33), неспособный продуцировать внеклеточную эндонуклеазу, чувствительный к ампициллину. Штамм может быть использован в генетических исследованиях и получении штаммов-продуцентов биологически активных веществ. Цель изобретения - получение штамма SERRATIA MARCESCENS ВКПМ В-3858/33/, отличающегося отсуствием способности продуцировать внеклеточную эндонуклеазу, чувствительного к ампициллину. Использование предлагаемого штамма делает невозможным отбор трансформированных клеток и выделение из них плазмидной ДНК. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РШ1УЬЛИН (19) И11

А1

$))$ С 12 N 1/20 9 14

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДФРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ fNHT ССОР (21) 4392446/31-13 (22) 15.03.88 (46) 15.08,90. Бо.".. У 30 (71) Казанский государственный университет им. В.И.Ульянова-Ленина (72) О.А.Гимадутдинов, О.В,Порфирьева и Д.В.Юсупова (53) 577.15(088.8) (56) I. Bacteriol, 1973, ъ . 113, 1, р. 508 — 509.

Шахнабатян Л.Г., Исаева Л,В. и др. — Биотехнология, 1987, т. 3, 11 1, с. 14-16. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ SERRATIA MARCESCENS) ИСПОЛЬЗУЕМЬЙ ДЛЯ ТРАНСФОРМАЦИИ

ДНК С ГЕНОМ УСТОЙЧИВОСТИ К АМПИЦИЛЛИНУ (57) Изобретение относится к микроИзобретение относится к микробиологической промышленности, представляет собой новый штамм бактерий

Serratia marcescens, неспособный продуцировать.внеклеточную .эндонуклеазу (К.Ф.3,1.4.9), чувствительный к ампициллину, и может быть исполь" зован в генетических исследованиях и получении штаммов — продуцентов биологически активных веществ.

Цель изобретения — получение штамма Serratia marcescens ВКПМ В-3858 (33), отличающегося отсутствием способности продуцировать эндонуклеазу и чувствительного к ампициллину.

Штамм предлагается использовать как реципиент для введения в него

2 биологической промышленности и преп тавляет собой новый штамм бактерий,"егга да marcescens ВКПМ В-3858 (11 33), неспособный продуцировать внеклеточную энлонуклеазу, чувствительный к ампициллину. Штамм может быть использован в генетических исследованиях и получении штаммов продуцентов биологически активных веществ. Цель изобретения — получение штамма Serratia marcescens ВКПМ

В-3858(33), отличающегося отсутствием способности продуцировать внеклеточную эндонуклеазу, чувствитель-ного к ампициллину. Использование предлагаемого штамма делает невозможным отбор трансформированных клеток и выделение иэ них плазмидной

ДНК. 2 табл. методом трансформации рекомбинантных молекул, несущих гены биологически активных веществ и устойчивости к ампициллину и создания таким образом на его основе штаммов — суперпроду- центов.

Создание штяммов — продуцентов биологически ю гивных веществ поедусматривает введение в клетки бактерий. посредством трансформации рекомбинантных молекул ДНК, несущих наряду с геном биологически активного вещества ген устойчивости к какому-либо антибиотику, Последующий отбор клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК, ведется по устойчивости к этому антибиотику.

1585327

Высокая нуклеазная активность клеток S. marcescens затрудняет введение в них рекомбинантной ДНК, с помощью трансформации; Высокая устойчивость штаммов S. marcescens к большому числу антибиотиков, в том числе к ампициллину, затрудняет отбор клонов, несущих рекомбинантные молекулы, и делает невозможным использование большинства векторов, несущих ген устойчивости к ампициллину.

Штамм получен методом индуцированного мутагенеза при облучении музейного штамма Serratia marcescens

Ви 211 АТСС9986 ультрафиолетовым светом с последующим отбором колоний, не обладающих эндонуклеазной активностью. На следующем этапе купьтуру, полученную из колонии, не обладающей эндонуклеазной активностью обрабатывали N-метил-N-нитрозо-N-нитрогуанидином с последующим отбором колоний, чувствительных к ампициллину.

Штамм S, marcescens У 33 имеет следующие свойства, Морфология. Клетки палочковидные размером 0,6-0,5 «1,0 мкм, одиночные, парные или соединенные в цепочку, грамотрица тельные, подвижные.

Куль туральные и физиологические свойства. На МПА.через 24 ч роста блестящие гладкие колонии ярко-красного цвета, выпуклые, с ровным к.ра° ем, диаметром 1,5-2,0 мм, На картофеле — блестящий красный налет. Молоко свертывает, но не пептонизи,рует, желатин разжижает, Ферментирует с образованием кислоты глюкозу, сахарозу, мальтозу, сорбит, инозит, маннит, салицилат. Не ферментирует лактозу, адонит, дульцит, ксилозу, арабинозу, рамнозу. Не ðañщепляет мочевину. Сероводород, индол не образует. Реакция Фогес-Проскауэра положительная, реакция с метил-рот — отрицательная, Оптимальная температура роста 28-30 С, рН о среды 7,4-7,6..

Эндонуклеазная активность. Не образует зоны деполимеризации ДНК:вокруг колоний в процессе роста на индикаторной агаризованной среде в течение 24 ч. Эндонуклеазная активность не обнаруживается в культуральной жидкости штамма (определеННр по продуктам гидролиза ДНК) при выращивании в течение 36 ч на качалке (180-300 об.мин 1) на модифиииоованной среде Бантинг. Следовая эндонуклеазная.активность (1,04,0 виск. ед. мл.- в культуральной жидкости и 0,5-.1,0 виск. ед. мг-" белка в клеточных лизатах) обнаруживается вискозиметрическим Методом.

10 Чувствительность к ампициллину.

Штамм не растет на мясопептонном агаре при концентрации ампициллина

25 мкг на 1 мл среды.

Пример .1. Попучение штамма, неспособного продуцировать внеклеточную эндонуклеазу, чувствительно" го к ампициллину.

Исходный штамм Ви-211 АТСС 9986 выращивают на мясопептонном агаре в течение ) 8 ч при 28+ 0,5 С. Выросшие клетки смывают 0,5%-ным физиологическим раствором, осаждают пентрифугированием и ресуспензируют в

0,1 NNa-фосфатном буфере до величи25 ны оптической плотности 0,12-0,15 при 650 нм. Полученную суспензию клеток облучают бактерицидной ультрафиолетовой лампой Буф-2 на расстоянии 60 см в течение 100 с. К облученной суспензии добавляют мясопептонный бульон (1/3 объема суспензии) и инкубируют в темноте в течение

3 ч при 28 С. После инкубирования о клетки высевают в чашки Петри с мя сопептонным агаром, в который был добавлен индикатор (для выявления продуцентов эндонуклеазы), содержащий 0,6 мг/мл дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК)и 0,01% толуидиново4 го голубого, окрашивающий среду с

ДНК в голубой цвет. Вокруг колоний, выделяющих эндонуклеазу через 24 ч роста, в результате гидролиза ДНК образовывался ореол розового цвета.

45 Отбирают колонии, не образующие зоны гидролиза ДНК на среде с толуидиновым синим, Все отобранные вари-. анты проверяли на эндонуклеазную активность. В результате был отобран мутант, неспособный продуцировать неспецифическую внеклеточную

1 эндонуклеазу.

Полученный мутанг засевают в колбы с мясопептонным бульоном до oil

55 тической плотности 0,05 при 650 нм.

Культуру выращивают на качалке до оптической плотности 0,5, осаждают клетки центрифугированием, промывают О,l М цитратным буфером, рН 5,5 ° в 20 раз измеряли оптическое поглоще ние при 260 нм на спектрофотометре

СФ-16. 3а единицу активности принимали количество фермента, которое дает увеличение оптической плотности в опытных образцах, по сравнению с контрольными (реакционная смесь без фермента) на одну оптическую единицу за 1 ч инкубации в пересчете на

1 мл культуральной жидкости (опт. ед, мл ч ). В качестве субстрата использовали препараты высокомолекулярной ДНК, выделенной иэ тимуса теленка по методу Кея в модификации Бенинга или коммерческИе препараты высокомолекулярной ДНК.

Результаты определения внеклеточной эндонуклеазной активности ис20 ходного и предлагаемого штамма представлены в табл. 1.

Как видно из данных табл. не обнаруживается эндонуклеазная ак° тивность в культуральной жидкости и клеточных лизатах предлагаемого штамма Ф 33 по образованию кислоторас тв оримых продуктов расщепления

ДНК. Обнаруживается следовая эндонуклеазная активность, равная 1, О4,0 виск.ед. мл- и 0,5-1,0 виск, ед. мг белка, в культуральной жидкости и клеточных лизатах штамма соответственно вискоз метрическим методом °

Эндонуклеазная активность в культуральной жидкости исходного штамма

АТСС 9986 на 36 ч выращивания равна 4000,0-6000,0 виск, ед. мл, 960,0-1500 0 оптич. ед. мл ч - или

1,6-2,5 мкМ расщепленной ДНК на мл в 1 мин. В бесклеточных лизатах исходного штамма также обнаруживается высокий уровень эндонуклеазной активности, равный 90,0-100, О виск. ед, 35 0-40,0 оптич, ед., 0,05-0,07 мкМ мл мин в расчете на I мг белка.

Пример 3. Трансформация клеток мутантного штамма II 33 (не обладающего нуклеазной активностью чувствительного к ампициллину /nuc. ашрам/ ДНК лазмиды pUC 19, несущий ген устойчивости к ампициллину.

Ночную культуру штаммов S. marcescens 33 и 9986 засевают в МПБ и выращивают прн интенсивной, аэрации до оптич еской плотности О, 1 0-0, 1 5 при

7! 650 нм (I -10 — 2.! О кл/мл).

Выросшие клетки осаждают на холоду

5 1585327

Затем клетки суспендируют в том же буфере до оптической плотности 0,4, добавляют N-метил-N-нитрозо-N -нитрогуанидин (Koch-Lidht) до концентрации 75 мкг/мл, инкубируют 30 мин о при 37 С. После инкубации клетки осаждают центрифугированием, промывают 0,1 M фосфатным буфером, рН 7,0, и рассевают в чашки Петри с мясопептонным агаром. Выросшие колонии проверяют на способность к росту на мясопептонном агаре с ампициллином (25 мкг/мл) и на эндонуклеазную активность . В результате отобран мутант Р 33, неспособный продуцировать неспецифическую внеклеточную нуклеазу .и чувствительный к ампициллину.. (Пример 2. Изучение эндонуклеазной активности. Исходный штамм

Ви 211 АТСС 9986 и штамм Ф 33 выра= щивают в течение 1 сут в пробирке со скошенным мясопептонным агаром, смывают 0,5Х-ным физиологическим раствором и засевают (из расчета

1 мл инокулята íà 100 мл среды) в колбу объемом 1 л со 100 мл среды.

Бактерии выращивают на среде, содержащей,. г/л: глицерин 5,0; цитрат аммония 5,0; двузамещенный фосфат калия 10,0; сернокислый магний 0,5; хлористый натрий 0,5; сернокислое железо 0,05; гидролизат казеина 1,0; дрожжевой экстракт 3,0, рН среды

7,6. Выращивание ведут на качалке 35 (180-200 об ° мин ) при оптимальной температуре 28 0,5 С в течение 36ч.

Затем бактериальные клетки отделяют центрифугированием при 6000g «20 мин.

Клеточные лизаты получают 11-кратным 40 замораживанием бактериальных клеток с последующим оттаиванием. В надосадочной жидкости и клеточном лизате определяли эндонуклеазную активность вискозиметрически и по продуктам 45 гидролиза высокополимерной ДНК, растворимым в 27.-ной НС104. Реакционная смесь объемом 1,0 мл содержала 1 мг

ДНК; 0,07 M трис-буфера, .рН 8,5;

0,007 М MgS04, 0,1 мл культуральной 50 жидкости, освобожденной от микробных клеток. Реакционную смесь инкубировали 15-20 мин при 37 С, реакцию останавливали добавлением 4Ж-ного раствора охлажденной НС10 в объеме, 55 равном объему реакционной смеси. Осадок удалялИ центрифугированием на холоду при 6000g 20-30 мин. В над.осадочной жидкости после разведения

1585327 на мл культуральной жидкости

Активность эндонуклеазы, на мг белка клеточного

Штамм лизата мкМ расщепленной

ДНК9 мл мин виск, ед. оптич. ед.

1 6-25

А Л.

960-1500

0,05-0, 07

35,0-40,0

1 0-5 0

А

0,5-1,0

Р 33

Не обнаружена

Не обнаружена

Не обнаружена

Не обнаружена

Таблица 2

Испытуемый штамм

К ол ич ес тв о устойчивых к ампицилКоличество

Наличие плаз— взятых для трансформации реципиентных клемиды в клетках, выросших на среде с ампициллином после трансформации лину клеток после трансформации плазмидой

pUC l9 ток

350

Сплошной рост в течение 4 мин при 4000g и отмывают от питательной среды холодным раствором, содержащим.10 мМ трнс-НС1 (рН 8,0).

Отмытые клетки вновь осаждают при тех же условиях. Осадок ресуспендируют в половине начального объема охлажденного во льду раствора, содержащего 30 мМ СаС1, 1 0 мМ трис-НС1 (рН 8,0) и вьдерживают в течение

15 мнн во льду. Клетки вновь осаждают и ресуспендируют в 1/15 начального объема выше указанного раствора, Затем суспензию оставляют на 20 ч при 40 С, после чего к ней добавля- ., ют раствор плаэмидной ДНК pUC 19 в количестве 1 мкг. и вьдерживают при

4 С в течение 30 мин. Затем пробы о переносят в водяную баню, нагретую до 42 С, и.выдерживают в течение о

2 мин. После инкубации проб при 42 С к ним добавляют по 1 мл МПБ и ставят в термостат на 30 С на 1 ч. Затем клетки высевают на MIIA в который

Ви-211 АТСС 9986 4000-6000

900-100,0 ф 33 — мутантный 1,2 10

У 9986 — исходный 5к! О" в качестве селектирующего агента,добавлен ампициллин в концентрацйи

200 мкг/мл. Посевы инкубируют при

30 С в течение 48 ч, после чего подсчитывают количество устойчивых к ампициллину клеток. Наличие в клетках плазмидной ДНК определяли методом щелочного лизиса с последующим электрофорезом в агароэном геле, Результаты эксперимента представлены в табл. 2.

Как видно из данных табл ° 2, использование для трансформации клеток исходного штамма, обладающего нуклеазной активностью и устойчивос тью к амп ициллину, дела ет нев о зможным отбор трансформированных клеток и выделение из них плазмидной ДНК, 20

Формула изобретения

Штамм бактерий Serratia marcescens

ВКПМ В-3858, используемый для трансформации ДНК с геном устойчивости к ампициллину.

Таблица 1