Способ выделения эндонуклеазы из культуральной жидкости sеrrатiа маrсеsсеns

 

Эндонуклеаза, выделяемая из культуральной жидкости SERRATIA MARCESCENS, гидролизующая нуклеиновые кислоты до ди-, три-, тетра-, и олигонуклеотидов, применяется для лечения и профилактики вирусного паралича пчел, для изучения структуры хроматина, может служить моделью для исследования влияния одновременного наличия сульфгидрильных и дисульфидных групп на конформационные переходы молекул. Цель изобретения - упрощение и ускорение процесса. Способ выделения эндонуклеазы из культуральной жидкости S.MARCESCENS включает катионообменную хроматографию на бикарбе с сорбцией фермента при рН 5,0-5,5 и десорбцией при рН 8,0-8,5 в присутствии 0,35-0,40 М хлористого натрия. Способ позволяет за 40-45 ч из 100 л культуральной жидкости выделить 70-110 г препарата, содержащего 7-14 г белка без уменьшения степени чистоты препарата с сокращением времени выделения фермента в 8-10 раз и упрощением процесса по сравнению с известным. 1 з.п. ф-лы.

ф

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (51) 4 С 12 N 9/14

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ WHT СССР (21) 4306951/31 — 13 (22) 26.06.87 (46) 07.05.89. Бюл ¹ 17 (71) Казанский государственный университет им.В.И.Ульянова-Ленина, Вышневолоцкий завод ферментных препаратов и Институт высокомолекулярных соединений АН СССР (72) М.Н.Филимонова, И.Б.Лещинская, P Б.Пономарева, В.И.Гребеньков, В.Н.Жбанова, Т .Д .Муравьева и К.П.Папукова (53) 577.15(088.8) (56) Yonemura К., Matsumoto К., Maeda Н. Isolation and Characterization of Nuclease from Clinical

Isolate of Serratia marcescens.

J. Biochem., 1983, . 93, ¹ 5, р. 1287.

Авторское свидетельство СССР

¹ 537512, кл. С 12 N 9/10, 1972.

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения фермен— тов, в частности внеклеточной бактериальной эндонуклеазы.

Целью изобретения является упрощение и ускорение процесса.

Способ выделения эндонуклеазы из культуральной жидкости S.marcescens основан на том, что катионообменную хроматографию проводят на катионообменнике. Биокарб Д-24 с сорбцией

ÄÄSUÄÄ 1477742 Д1 (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ

ИЗ КУЛЬТУРАЛЪНОЙ ЖИДКОСТИ SERRATIA

MARCESCENS (57) Изобретение предназначено для лечения и профилактики вирусного .паралича пчел, для изучения структуры хроматина, может служить моделью для исследования влияния одновременного наличия сульфгидрильных и дисульфидных групп на конформационные переходы молекул. Цель изобретения — упрощение и ускорение процесса. Способ выделения эндонуклеазы из культуральной жидкости S.marcescens включает катионообменную хроматографию на биокарбе г с сороцией фермента при рН 5,0-5,5 Я и десорбцией при рН 8,0-8,5 в присутствии 0,35-0,40 М хлористого натрия. Способ. позволяет за 40-45 ч из 100 л культуральной жидкости выделить 70 †1 г препарата, содержащего 7-14 г белка, без уменьшения степени чистоты препарата с сокращением времени выделения фермента в

4:ь

8-10 раз и упрощением процесса по сравнению с известным. 1 з.п. ф-лы.

2 И) целевого продукта при рН 5055 и цесорбцией при рН 8,0-8,5 в присутствии 0,35-0,40 М хлористого натрия.

Пример 1. Г>иокарб Д-24 800 г (по сухому весу) уравновешивают

О, 10 М натрий-ацетатным буфером рН 5,2, перемещают в колонку диаметром 2530 см. 100 л культуральной жидкости подкисляют концентрированной уксусной кислотой до рН 5,2 и наносят на сорбент со скоростью 60 мл/см" ч (около

1477742

Формула и з о б р е т е н и я

1,: Способ выделения эндонуклеазы из культуральной жидкости >erratia

marcescens включающий очистку методом ионообменной хроматографии, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения и сокращения длительности процесса, ионообменнрй хроматографии подвергают непосредственно культуральную жидкость, а ионообменную хроматографию проводят на катионообменнике Биокарб Д-24 с сорбцией целевого продукта при рН

5,0-5,5 и десорбцией в буфере при рН 8,0-8,5 в присутствии 0,350,40 М хлористого натрия.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что для десорбции в качестве буфера используют 0 1 М трис-HCl.

Составитель А. Семенов

Редактор А. Гунько Техред A.Êðàí÷óê Корректор 3.Лончакова

Заказ 2316/25 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Па-.ент", r.Óæãoðoä, ул. Гагарина, 101

30 л/ч) при соотношении белок:сорбент не более 700 ед. А !! . 1 см бискарба. По завершении сорбции колонку промывают 25,5 л (15-кратный объем)

0,05 М трис-НС1 буфера, рН 8,5. 3a- .

5 тем элюируют фермент 8,5 л (5-кратный объем) 0,10 М трис — НС1 буфера рН 8,5, содержащего 0,40 М хлористого натрия.

Полученный элюат высушивают при дроб- 1О ном режиме. При этом выход фермента составляет 65-703, активность не менее 30000 ед,акт./мг белка. Из

100 л культуральной жидкости удается выделить более 100 r препарата, содержащего более 10% белка.

Пример 2. Биокарб Д-24: уравновешивают 0,10 М натрий-ацетат- ным буфером, рН 5,0 и помещают в колонку как в примере 1. Культураль- 20 ную жидкость подкисляют концентрированной уксусной кислотой до рН 5,0 и помещают на колонку как в примере 1. Сорбция эндонуклеазы составляет

90-95Х, Промывку колонки и элюцию фермента проводят как в примере 1.

При этом выход фермента составляет

60-65Х, активность около 25000 ед.акт./

/мг белка.

Пример 3. Биокарб Д-24 уравновешивают О, 10 М натрий-ацетатным буфером, рН 5,5 и помещают в колонку как в примере 1. Культуральную жидкость подкисляют концентрированной уксусной кислотой до рН 5,5 и помещают на колонку как в примере 1. Сорбция эндонуклеазы составляет 40-87 ",.

Промывку колонки и элюцию фермента проводят как в примере 1. При этом выход фермента составляет 35-652, ак4О тивность около 30000 ед.акт./мг

I белка.

Пример 4. Биокарб Д-24 уранновешивают и помещают в колонку как в примере 1. Культуральную жидкость наносят на колонку как в примере 1.

Промывку колонки про :,одят как в примере 1. Фермент элюируют 0,1 М трис-НС1 буфером, рН 8,0, содержащим.

0,35 М хлористого натрия. При этом выход фермента составляет 60-657., активность, более 30000 ед,акт,/мг белка.

Пример 5. Биокарб Д-24 уравновешивают и помещают а колонку как в примере 1. Культуральную жидкость наносят на колонку как в примере 1.,Промывку колонки проводят как в примере 1. Фермент элюируют 0,1 М трис-HCl буфером рН 8, 5, содержащим

0,35 М хлористого натрия. При этом выход фермента составляет 65-707.. активность более 30000 ед.акт./мг белка, При осуществлении способа в усло. виях, отличающихся от описанных, выход целевого продукта снижается.

Реализация способа обеспечивает упрощение и ускорение процесса.