Штамм бактерий bacillus species 21-продуцент сайт- специфической эндонуклеазы rse21 1

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии. Целью изобретения является выявление штамма-продуцента BACILLUS SPECIES ВКПМ В-3672, селективно продуцирующего с высоким выходом сайт-специфическую эндонуклеазу рестрикции, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5Ъ-CCTNAGG-3Ъ. штамм выделен в результате поиска штаммов-продуцентов рестриктаз из морской воды бухты Золотой Рог залива Петра Великого Японского моря. Предлагаемый штамм нетребователен к питательным средам, легко разрушается ультразвуком, обеспечивает повышенный выход целевого фермента, составляющий 30000 ед/г биомассы. Штамм BACILLUS SPECIES В-3672 продуцирует сайт-специфическую эндонуклеазу BSE 21 1, имеет сайт узнавания 5Ъ-CCTNAGG-3Ъ, идентичный сайту узнавания рестриктазы SAU 1, и может полностью заменить известный во всех генно-инженерных работах.

СОЮЭ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1518372 А 1 (51) 4 С 12 N 9/14 1/20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЭОБРЕТЕНИЯМ И OTHPblTHAM

ПРИ ГКНТ СССР

gЯf0(1 м " I j

Н А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

2 (57) Изобретение относитя к микробиологической промышленности и генной инженерии. Цель изобретения— выявление штамма-продуцента Bacillus

species ВКПМ В-3672, селективно продуцирующего с высоким выходом сайтспецифическую эндонуклеаэу рестрикции, способную узнавать и расщеплять

I последовательность нуклеотидов 5

CC7NAGG-3 . Р1тамм выделен в результате поиска штаммов-продуцентов рестриктаз иэ морской воды бухты Золотой

For Петра Великого Японского моря.

Предлагаемый штамм нетребователен к питательным средам. легко разрушается ультразвуком, обеспечивает повыЖ шенный выход целевого фермента, составляююий 30000 ед/г биомассы. О1тамм (/)

Bacillus species В-3672 продуцирует сайт-специфическую эндонуклеазу

Bse 21I имеет сайт узнавания 5

CCTNAGG-3,,идентичньж сайту узнавания рестриктазы Sau I, и может пол ностью заменить известный во всех

4ч генно-инженерных работах. I (2!) 4361460/28-13 (22) 11,01.88 (46) 30.10.89. Бюл. В 40 (71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ и Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения

АН СССР (72) С.Х. Дегтярев, В.Е, Репин, Н.И. Речкунова, Л.С, 1Певченко, Е.П. Иванова и В.А. Рассказов (53) 577.15(088.8) (56) Catalog "Biolabs", 1986/1987.

Calleja F. de Marsac N.Т,, Covisin T. van 0rmondt Н. de Waard А, Nucl. Acid, Res, 1985, 13,18, 6745-675

Timko I. Horwits А., Zelinka I, Wilcox G.-I. Bacteriol., 1981, 145, 873-877. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus species

21 — ПРОДУЦЕНТ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ Bse 21 I

Изобретение относится к микробиологической промышленности и генной инженерии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайтспецифическую эндонуклеаэу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 -ССТИСС-3 .

Цель изобретения — выявление штамма-продуцента Bacillus species 21 (ВКПМ В-3672), селективно продуцирующего с высоким выходом сайт-специфическую эндонуклеаэу рестрикции, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеодитов 5 —

CC7NGG-3 .

Предлагаемый штамм выделен в результате поиска штаммов-продуцентов рестриктаз иэ морской воды бухты Золотой Рог залива Петра Великого

Японского моря, продуцируемая им рестриктаза названа Bse 2! согласно

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1518372

40,0

27,0 общепринятой номенклатуре Натана и

Смита.

1 1тамм Bacillus species 21 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки палочковидные, прямые, 0,61,0 и 1,5-2,5 мкм (иногда до 5 мкм), подвижные. Образуют эндоспоры овальной формы(не более одной в спорангии) 10

Расположение спор преимущественно центральное, без отчетливой раздутости спорангии. Околоспоральных тел не обнаружено. Споры термоустойчины.

Отмечается грамвариабельнссть.

Культуральные признаки, Хорошо растут на обычных питательных средах (СПА, МПБ), нетребовательны к факторам роста. На агаризованных средах образуют круглые, плоские колонии беловатого цвета. Края ровные.

При росте в ферментерах помутнение равномерное. Оптимальная температура роста 30 Г °

Культуру поддерживают пересевом на агаризованных чашках Петри. Хорошо хранится под вазелиновым маслом, о в растворе глицерина — при -70 Г и в лиофильно высушенном состоянии, Физиологические признаки, Хемоорганотроф. Каталазоположи" тельный, оксидазоотрицательный. утилизирует лактозу, сахарову, мальтоэу, арабинозу, глюкозу, галактозу, маннит. Не утилизирует раннозу, ксилоэу, дульцит сорбит. Реакция Фогео-Проска35 уэра отрицательная, Разжижает желати-ну и крахмал.

Для культивирования Bacillus

species 21 В-3672 применяют питательную среду следующего состава, г/л дистиллированной воды:

Гидролизат кильки

NaC1

Вода дистиллированная Остальное о

Культивирование проводят при 30 Г и интенсивной аэрации до достижения стационарной фазы роста.

Выход биомассы: 2,0-3,0 г сырой биомассы с 1 л питательной среды.

Выход целевого фермента: 3000 ед/г биомассы с удельной активностью

20000 ед/мп, Лтамм выращивают н питательной среде следующего состава, г/л: гидролизат кильки 40; VaC1 27; остальное вода. Культивирование выполняют при интенсивной аэрации (2 об./мин), перемегинании (150 об,/мин) при 80 С до конца фазы замедления роста (5 ч).

Клетки собирают центрифугированием при 1000g и температуре 4 С. Выход биомассы составляет 2,2 г/л, Биомассу весом 2,2 г суспендируют в 20 мл

0,02 C трис-НГ1 буфера, рН 7,5, содержащего 10 3 M меркапэтанола и 0,1% тритона Х-100, и разрушают на ультразнуковом диспергаторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием (12000g, 30 мин) и надосадочную жидкость наносят на колонну с биогелем А 0,5 М (Bio Rad) объемом 600 мл, уравновешенную 0,02 М .:алийфосфатным буфером, содержащим 10 М меркапэтанола, 5 IO М ЭДТА, 0,8 М NaCl и 0,1% тритона X-100 (буфер А). Фермент элюируют и тем же буфером со скоростью

20 мл/ч, Фракции объемом 10 мл собирают и анализируют на присутствие активного фермента. Фракции, содержащие максимальную рестриктазную активность, объединяют и диализуют против

2 л 0,02 М калийфосфатного буфера, рН 7,5, содержащего 10 М меркагэтанола и 5 .1О М ЭДтА (буфер В), трижды меняя буфер. Диализаг наносят на колонку с ДЕАЕ-целлюлозой объемом

20 мл (ДЕ-52 Qlhatman), уравновешенную буфером В. Колонку промывают буфером В цо исчезновения УФ-поглощающего материала в элюате. Фермент не орбируется на ДЕАЕ-целлюлозе.

Раствор фермента наносят на колон-. ку с фосфоцеллюлозой (P-ll, 1 Ъа шап) объемом 5 мл, уранновешеннук: буфером В, и промывают колонку тем же буфером. Элюирование фермента проводят (100 мл) градиентом NaCl,от П,,0 до

1,0 М в буфере В, Объем каждой фракции 5 мч. Фракции H-IO, содержащие рестриктазу, объединяют и диализуют против буфера В, содержащего 0,1 М

NaCI и 50%-ный глицерин.

3а единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления ! мкг ДНК фага в течение 1 ч при

37 С. Ферментный препарат хранится в глицерине при — 20 С. Выход фермента 30000 ед/1 r биомассы бактерий, уд. активность 20000 ед/мл.

Полу енный штамм по сравнению с известным обеспечивает повышенный выход целевого фермента, составляющий 30000 ед/г биомассы (в 30 раз

Составитель И. Привалова

Редактор М. Петрова Техред М.Ходанич Корректор Э. Лончакова

Заказ 6568/31 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открьггиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-иэдательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101

5 15 больше, чем известный штамм); не требует длительного культивирования, легко разрушается ультразвуком.

Поскольку рестриктаза Bie 21 имеет сайт узнавания 5 -CCTNAGG-3, идентичный сайту узнавания рестриктазы, 18372 „ 6 она может заменить известную во всех генно-инженерных работах.

Формула и з обре т е н и я

Нтамм бактерий Bacillus species 21

ВК?И В-3672 — продуцент сайт-специфической эндонуклеазы Bse 21 I.