Питательная среда для культивирования бактерий providencia sтuаrтii - продуцента рестриктазы рsт 1

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается состава питательных сред для культивирования бактерий PROVIDENCIA STUARTII-продуцента рестриктазы PST 1. Целью изобретения является повышение выхода рестриктазы PST 1. Питательная среда содержит в качестве источников углерода глюкозу в количестве 1,5-2,5 г/л и лактозу в количестве 2,5-3,5 г/л, а в качестве питательной основы - рыбный гидролизат в количестве 45-50 г/л и воду до 1 л. В результате использования предложенной среды выход рестриктазы PST 1 возрастает с 400-600 ед/г биомассы до 75000-80000 ед/г биомассы или с 3000-4800 ед/л культуральной жидкости до 562500-640000 ед/л культуральной жидкости по сравнению с известным способом.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК..rS>rrrr 15 2 (51) 4 С 12 V I/20 9/14

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АBTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

2 (54) ЦИТАТЕ)!ЬНЛЯ СРГДЛ Д)!Я Ку !ЬТ!1ВИРОБЛНИЯ БАКТЕРИЙ РROVIDFNCTA STUARTII — ПРОДУИЕНТЛ PF.GTÐIIÊTAÇlr! PST (57) Изобретение относится к биотехнологии и клслется состлвл питлтельных сред для культиниронлния бактерий

Providenc i a s tuar t i i. — и родуцентл рестриктлзы Ряс. l. Целью изобретения является поньппение выходл рестрнктлs«I Pst l, Питлтельнля срелл содержит н качестве источников углеродл глнкозу н количестве 1,5-2,5 г/л и ллкточу н количестве 2,5-3,5 г/л, л н качестве питательной основы — рыбный гидролизлт н количестве 45-50 г/л и воду до 1 л. 1! результате использования предложенной среды выход рестриктлзы Pst нозрлстлет с 400600 ед. /г биомассы до 75000-80000 ед. /г биомлссы или с 1()00 — 480() < д. /л куль— турлльной жидкости дс 56" 500640000 ед. /л культур Irrl»I«й жидкости по срлвнению с известным с пособом. кзчестгцлронин ком— лизат при след понентов, г/л:

Рыбный гидр

Глюкозл

Ллкто Ia ую|цем оооч н< гн

0 — 50,0

5-,5

5-З,5 олизлт

Вод 1

Питлтельнля среда оГ с r»lr lll»лет интенсификлцию »»коллеlll «р отри.. лз—

1 ! (2I) 4324975/28-13 (22) 04.11..87 (46) 23.08,89. Бюл. !! 31 (71) Научно-производственное объединение "Биолар" и Научно-производственное объединение "Бектор (72) !п.Н.Бойков и В.F,.Ðåïèí (53) 577,15(088.8) ! (56) Smith D,I. Blattner F.R. Davies .1. "The isolation and partial

characterization of à new restriction endonuclease from Providencia

stuartii", J. Nucleic Acids Res, 1976, ч. 3., !! 2, р. 343-353.

Green P.J., Heyneker Н.L., Bolivar F., Rodriquez К.L., Betlach Y..С., Covarrubias А.А., Backman К., Russel D.J° .,, Tait R., Boyer H.W. "А general method for the purification

of restriction enzymes". J. Nucleic

Acids Res. 1978, ч. 5, h 7, р. 23732380.

Лабораторная методика производства биомассы Providencia stuartii

Утв. 03,10,81. НПО "Биолар".

Изобретение относится к биотехнологии, а именно касается cocTaâл питательных сред для культивиронания бактерий Providenci.a stuarгii — продуцента рестриктлзы Рst !.

Целью изобретения нн нетсн цовьпиение выхода рестриктлзы Pst !.

Питательнлн среда длч кул) ти»иронлния блктерий Prnviс1епсiл stuar—

tii — продуцентл рестрикl;l и Pst включает в клчесT»t источнплî» углерода глюкозу и лактозу, л в не питательной основы рыбный

3 1502616 ной активности, за счет чего повышается выход целевого продукта °

Пример 1. Питательная среда содержит, г/л:

Рыбный гид ролизат 50,0

Глюкоза 2,5

Лактоза 3,5

Вода До 1 л

Оживление штамма Providencia stuагtll 17 ВКПМ В-4076 осуществляют на сухом питательном агаре (сухой питательный агар 35,0 г/л, вода

1,0 л) в чашках Петри. Инкубируют в о термокамере при 37 С в течение 15

18 ч.

С поверхности агара в чашках Петри культуру переносят бактериологической петлей в качалочные колбы данного состава, рН 7,4, 20

Выращивают посевной материал при

37 С в течение 18 ч на качалке. о

Ферментацию культуры проводят на питатель ной среде данного состава при следующих условиях: рН 7,4;

37 С; перемешивании 200 об/мин; подаче воздуха — 2 объема воздуха на

1 объем питательной среды; выращивании до достижения оптической плотности бактериальной суспензии

l,75 опт. ед. (ФЭК, фильтр У 6, кювета 0,5 см) °

Выход биомассы: 8,0 г/л культуральной жидкости °

Выход рестриктазы Pst 1: 35

80000 ед./г биомассы, 640000 ед./л культуральной жидкости.

В предлагаемом изобретении для определения активности использован метод электрофореза в геле. Актив- . 40 ность определяли в грубом экстракте биомассы бактерий Providencia stuartii 17 ВКПМ В-4076 и в конце выделения (после хроматографии на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой). 45

3а единицу активности рестриктазы Pst 1 принимают минимальное количество фермента, которое требуется для полного расщепления 1 мкг ДНК о, Фага Ъ в течение 1 ч при 37 С.

Выделение фермента проводят следующим образом.

50 г биомассы бактерий суспендируют в 100 мл 10 мМ трис-НС1, буфера, рН 7,2, содержащем )О мМ 2-меркаптоэтанола, 1 мМ азид натрия, 1 мМ трилона Б (буфер А) и доводят этим же буфером до объема 150 мл. К суспензии добавляют 1,5 мл !0%-ного

45,0

1,5 тритона Х-100 и 150 мг лизоцима.

Лизис проводят ч при постоянном перемешивании. Дальнейшее фракционирование лизата проводят в системе двухфазного разделения.

Полученный лизат добавляют к смеси, состоящем иэ 37,0 мл 15%-ного водного раствора декстрана Т-500, 56 мл 30%-ного водного раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) и 35 мл 4,0 М хлористого натрия (рН смеси 6,5).

Тщательно перемешивают в течение

l5 мин и центрифугируют на центрифуге High speed (20000rq, 20 мин).

Верхнюю ПЭГ-фазу объемом 120 мл, со" держащую фермент, отбирают, разбавляют двухкратным объемом буфера А, добавляют тритон Х-100 (0,1%) и наносят на колонку с фосфоцеллюлозой, уравновешенную буфером А, содержащим 0,1%-й тритон Х-100 (буфер Б).

Фермент элюируют 0-1,0 M линейным градиентом концентрации натрия хлористого в буфере Б. Фракции, содержащие рестриктазу Pst 1, концентрируют диализом против буфера Б, содержащего 55%-й глицерин.

Получают очищенный фермент Pst I в виде прозрачной бесцветной жидкости.

Рестриктаза Pst 1 расщепляет ДНК (фаза Х в 18 сайтах).

Содержание нуклеаз — после выделения отсутствуют.

Хранят рестриктазу Pst 1 при

-10 С в течение 1 r.

Пример 2. Питательная среда содержит, г/л:

Рыбный гидролизат 47,5

Глюкоза 2,0

Лактоза 3,0

Вода До l л

Выращивание биомассы: адаптацию культуры, инокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводят подобно примеру I, Выход биомассы: 7,75 г/л культуральной жидкости.

Выход рестриктазы Pst 1:

77500 ед./г биомассы, 600625 ед./г культуральной жидкости.

Определение активности, выделение фермента Pst 1 и хранение проводят подобно примеру l°.

П р и м е,р 3, Питательная среда содержит, г/л:

Рыбный гидролизат

Глюкоза

1502616

Формула изобретения

Выход рес трик та эы P s t 1:

20000 ед./г биомассы, 84000 ед./л культуральной жидкости.

Определение активности, выделение фермента Pst 1 и хранение проводят г подобно примеру I.

П р н м е р 5. Питательная среда содержит, г/л:

Рыбный гидролизат

Глюкоза

Лактоэа

Вода

52,5

3,0

4,0

До 1,0 л

45-50

1,5-2,5

2,5-3,5

До 1 л

Составитель Н,Ходарев

Редактор В.Данко Техред M.Äèäûê Корректор И.Муска

Заказ 5045/35 Тираж 501 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открьггиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

Лактоза 2,5

Вода До 1,0 л

Выращивание биомассы: адаптацию культуры, инокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводят подобно примеру 1.

Выход биомассы: 7,5 г/л культуральной жидкости.

Выход рестриктазы Pst I:

75000 ед,/г биомассы, 562500 ед,/л культуральной жидкости.

Определение активности, выделение фермента Pst I и хранение проводят подобно примеру I.

Пример 4. Питательная среда содержит, г/л:

Рыбный гидролизат 42,5

Глюкоза 1,0

Лактоэа 2,0

Вода До I Îл

Выращивание биомассы: адаптацию культуры, инокуляцию посевного материала, ферментацню культуры проводят подобно примеру 1, Выход биомассы: 4,2 г/л культуральной жндкости.

Выращивание биомассы: адаптацию культуры, ннокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводят подобно прнмеру I, Выход биомассы: 4,5 г/л культуральной биомассы.

Выход рестриктазы Pst I:

15000 ед./г биомассы, 67500 ед./л

1О культуральной жидкости.

Определение активности, выделение фермента Pst 1 и хранение проводят подобно примеру I.

Таким образом, в результате ис15 пользования предложенной среды повышается вьгход рестриктаэы Pst 1 с

400-600 до 75000-80000 ед./г биомассы или с 3000-4800 до 562500640000 ед./л культуральной жидкости по сравнению с известным способом.

Питательная среда для культнви25 рования бактерий Providencia stuar— продуцента рестриктазы Pst 1, включающая источники углерода, аминного азота, витаминов и воду, о тл и ч а ю щ а я с я тем, что, с це30 лью повышения выхода рестриктазы

Pst I, она содержит в качестве источников углерода глюкозу н лактозу, а в качестве источников аминного азота и витаминов — рыбный гидролизат при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:

Рыбный гидролизат

Глюкоза

Лактоза

Вода