Способ определения активности протеолитических ферментов

 

Изобретение относится к энзимологии и может быть использовано для определения протеолитической активности ферментных препаратов в клинической биохимии. Цель изобретения - повышение чувствительности способа. Белковый субстрат иммобилизуют на формалинизированных эритроцитах. Затем инкубируют их с исследуемым ферментом при 36°С в течение 1 ч. В микропанелях разводят сыворотку против субстрата и добавляют обработанные ферментом эритроциты, инкубируют их Протеолитическую активность оценивают до степени снижения титра антисыворотки. По сравнению с прототипом увеличивается чувствительность способа в 500 раз

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)л G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4643210/14 (22) 26.01.89 (46) 28.02.91. Бюл, ¹ 8 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биотехнологии (72) Е.В,Сокуренко, М,С.Долгих и Д,Д.Абакумова (53) 615.274(088,8) (56) Germaine ОЯ, Teliefson,М., Johnson

G.L, Infection and Immunity, 1978, v 22, р.861 — 866. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ (57) Изобретение относится к энзимологии и может быть использовано для определеИзобретение относится к энзимологии и может быть использовано для определения протеолитической активности ферментных препаратов в клинической биохимии.

Целью изобретение является повышение чувствительности и специфичности метода.

Способ осуществляют следующим образом.

Антитела против субстрата получают иммунизацией кроликов или дру;их животных или используют готовую сыворотку.

Белковый субстрат иммобилизуют на формалинизированных эритроцитах через танниновую кислоту в дозе 100 мкг на 1 мл

5%-ной суспензии эритроцитов. Приготовленные эритроциты с субстратом, а также антитела сохраняют в холодильнике. Можно имобилизовать на тех же эритроцитах несколько разных белковых субстратов и затем определить специфичность фермента

„„ Ы„„ 1631433 А1 ния протеолитической активности ферментных препаратов в клинической биохимии, Цель изобретения — повышение чувствительности способа. Белковый субстрат иммобилизуют на формалинизированных эритроцитах. Затем инкубируют их с исследуемым ферментом при 36 С в течение 1 ч, В микропанелях разводят сыворотку против субстрата и добавляют обработанные ферментом эритроциты, инкубируют их. Протеолитическую активность оценивают до степени снижения титра антисыворотки. По сравнению с прототипом увеличивается чувствительность способа в 500 раз. по отношению к каждому субстрату отдельно на основе специфичных антител. Ферментный препарат инкубируют с белковым субстратом, иммобилизованным на эритро- О цитах, в термостате при 37 С в течение 1 ч (д в 0,02 м трис-буфере рН = 8,0, Формалинизированные эритроциты предварительно ф,. отмывают от формалина физиологическим ( раствором (ФР), 3

Иммунохимический анализ осуществляют в 96-луночном планшете. Делают ряд двукратных разведений антисыворотки известного титра в нормальной кроличьей сыворотке или в забуференном ФР по 25 мкл в лунке, Во все лунки добавляют инкубированные с ферментом и отмытые от него ФР субстратные эритроциты (по 25 мкл 0,5%ной суспензии в ФР, забуференном до рН

7,2). Агглютинацию учитывают через 1 ч визуально, Для каждой серии опытов параллельно устанавливают титр используемой

1631433 антисыворотки с данными субстратными эритроцитами, Более четкие результаты получают при выдерживании реакции гемагглютинации еще 1 ч в холодильнике. При ферментативной деградации иммобилизирован ного на эритроцитах субстрата снижается титр антисыворотки по сравнению с исходными (контроль) субстратными эритроцитами. Протеолотичекую активность исследуемого препарата оценивают по степени снижения титра антисыворотки (по укорочению агглютинационного ряда), Пример 1. Определение протеолитической активности трипсина с иммобилизованным фибронектином ц качестве субстрата.

В качестве субстрата используют фибронектин-гликопротеид плазмы человека (коммерческий препарат Харьковского завода бактпрепаратов). Антисыворотку к фибронектину получают, иммунизацией кролика. Использованный пул антисыворотки преципитирует с фибронектином в реакции

Очхтерлони до титра 1:2000. Фибронектин иммобилизуют на формализированных эритроцитах через танниновую кислоту в дозе 100 мкг на 1 мл 5%-ной суспензии эритроцитов в течение 3 ч при 37 С. Приготовленные таким образом эритроциты с иммобилизованным фибронектином хранят при 4 С в концентрации 10%.

Трипсин в количестве 1 мг растворяют в 1 мл трис-НС! или борноборатного буфера с рН 8,0, или в воде и быстро делают ряд разведений трипсина в том же буфере до концентрации 1 нг. Во все разведения добавляют суспензию эритроцитов с иммобилизованным на них фибронектином. На 1 мл ферментного препарата добавляют 15,0 мкл

10%-ной суспензии эритроцитарного субстрата. Инкубируют 1 ч при 37 С в термостате. Инкубированные образцы сразу же центрифугируют 5 мин при 3 тыс, об/мин и отмывают ФР от трипсина при повторном центрифугировании, ресуспендируют в ФР до концентрации 0,5% (300 мкл ФР добавляют к осадку эритроцитов).

Антисыворотку к фибронектину титруют в серии двухкратных разведений в объемах по 25 мкл. Для этого. исходную сыворотку с тетром 1:250000 разбавляют в.10 раз (50 мкл антисыворотки разбавляют 0,5 мл забуференного ФР с рН 7,2 ), Во все лунки добавляют отмытый иммобилизованный субстрат, центрифугированный после реакции с ферментом в объеме 25 мкл, и оставляют на 1 ч при комнатной температуре и еще на 1 ч в холодильнике. Затем читают реакцию, отмечая последнюю лунку, где уже не идет реакция агглютинации эритро10

20

25 позволяет уловить активность взятого пре30

55 цитов, Это разведение и отражает активность фермента, Трипсин в концентрации

10 мг еще расщепляет фибронектин, предотвращая реакцию агглютинации в сравнении с контрольным рядом.

Специфичность on ределения подтверждается экспериментом, при котором инкубация фермента с субстратом в присутствии соевого ингибитора полностью восстанавливает реакцию агглютинации по сравнению с той же концентрацией трипсина, где ферментативная реакция идет без ингибитора, Избыточное количество фермента (более 1 мгl мл) приводит к повреждению самих эритроцитов, и вследствие этого осуществляется реакция агглютинации, но по неспецифичному механизму.

Сравнение результатов, полученных предлагаемым способом и по способу-прототипу, выявляет существенно большую чувствительность предлагаемого способа, Так, определение протеолитической активности с использованием реакции агглютинации парата трипсина при концентрации последнего 100 нг, в то же время как способ-прототип улавливает трипсин лишь в концентрации 50000 нг, Таким образом, предлагаемый способ в

500 раз более чувствителен, чем способпрототип.

Предлагаемый способ является микрометодом, так как для одного определения на

1 ряд разведений требуется 3 мкг субстрата (в 300 мкл 0,5%-ной суспензии эритроцитов) и 100 нг (300 мкл) ферментного препарата— трипсина. Метод универсален и специфичен, так как на эритроцитах можно иммобилизовать любой белок и даже несколько белковых субстратов одновременно, Чувствительность метода и его специфичность увеличиваются благодаря применению антисыворотки к субстрату, а также за счет использования субстрата, иммобилизованного на твердом носителе, в данном случае на эритроцитах. Субстрат можно иммобилизовать также на латексных или на других подходящих частицах, Метод удобен при использовании дефицитных субстратов и при изучении высокоспецифичных ферментов, так как для постановки реакции и иммунизации требуется менее 1 мг белка.

Определение протеолитической активности предлагаемым способом не зависит от возможного процесса аутолиза во время инкубации и не зависит от гомогенности субстрата, Метод не требует дорогостоящего оборудования и прост в выполнении, а

1631433

Составитель В.Литовченко

Редактор M.Áàíäóðà Техред М.Моргентал Корректор М.Максимишинец

Заказ 541 Тираж 406 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Формула изобретения

Способ определения активности протеолитических ферментов, включающий инкубирование субстрата с ферментом, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности анализа, перед инкубацией субстрат иммобилизуют на зритроцитах, затем после инкубирования с ферментом. эритроциты обрабатывают антителэми к субстрату и по снижению титров антител в реакции агглютинации по сравнению с эрит5 роцитами, не обработанными ферментом, определяют наличие активности протеолитических ферментов,