Способ определения мембранотоксического действия химических веществ

 

Изобретение относится к медицине, медицинской и микробиологической промышленности , экологии, а именно к методам исследования и количественной оценки потенциальной опасности химических веществ , и может быть использовано в токсикологии для установления предельной концентрации мембранотоксического действия химических соединений, в промышленной гигиене для определения предельно допустимого уровня токсических веществ в окружающей среде. Цель изобретения заключается в ускорении способа определения мембранотоксического действия химических веществ. Сущность изобретения состоит в том, что клетки люминесцентных бактерий инкубируют с исследуемым веществом , центрифугируют и мембранотоксичность соединения определяют по появлению в супернатанте маркерного белка , люциферазы, определяя ее активность. Скорость определения мембранотоксичного действия веществ возрастает в 9 раз по сравнению с прототипом. 2 табл. сл с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

А

1 (21) 4635372/14 (22) 12.01.89 (46) 30.06.91. Бюл. И 24 (71) Красноярский государственный университет и Красноярский государственный медицинский институт (72) А.В.Светлаков, И.Ю.Виделец, В.В.Иванов и А.Н.Шендеров (53) 612.015(088.8) (56)Лазипага Het at. Toxicol. Appl, Pharmaeol.

1985, К79, hh 3, р.453-460. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕМБРАНОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ (57) Изобретение относится к медицине, медицинской и микробиологической промышленности, экологии, а именно к методам исследования и количественной оценки потенциальной опасности химических веИзобретение относится к медицине, медицинской и микробиологической промышленности, экологии, а именно к методам исследования и количественной оценки потенциальной опасности химических веществ, может быть использовано 8 токсикологии для установления предельной концентрации мембранотоксического действия химических соединений, s промышленной гигиене для определения предельно допустимого уровня токсических веществ в окружающей среде.

Цель изобретения — ускорение способа.

Способ осуществляют следующим образом.

К суспензии клеток ph.t elognatht добавляют исследуемое на токсичность химиче Ы, 1б59851 А1 ществ, и может быть использовано в токсикологии для установления предельной концентрации мембранотоксического действия, химических соединений, в промышленной гигиене для определения предельно допустимого уровня токсических веществ в окружающей среде. Цель изобретения заключается в ускорении способа определения мембранотоксического действия химических веществ. Сущность изобретения состоит в том, что клетки люминесцентных бактерий инкубируют с исследуемым веществом, центрифугируют и мембранотоксичность соединения on ределя ют по появлению в супернатанте маркерного белка, люциферазы, определяя ее активность, Скорость определения мембранотоксичного действия веществ возрастает в 9 раз по сравнению с прототипом. 2 табл.

3 ское вещество, инкубируют и центрируют.

Супернатант анализируют на содержание люциферазы. Для этого в кювету люминометра вносят 0,1 мл супернатанта и добав-, Ю ляют 0,02 мл 0,01%-ного спиртового (Я раствора миристинового альдегида. Кювету помещают в люминометр. Запуск реакции производят впрыскиванием 0,5 мл 0,05 мМ восстановленного флавинмононуклеотида.

Максимум световой вспышки регистрируют самописцем или цифровым прибором и выражают в микроамперах. Степень мембранотоксического действия химических веществ определяют по величине активности люциферазы в супернатанте.

Пример 1, Суспензию культуры

ph.Leiognatht разливают в ряд пробирок по

1659851

1 мл и приливают по 10 мкл бутилметакрилата в конечных концентрациях 0,5; 1,0; 2;

4; 8; 16; 32 мМ. В качестве контроля используют 10 мкл растворителя, на котором приготовлен раствор исследуемого 5 химического вещества. Приготовленную таким образом смесь инкубируют 5 мин при ,28 С. После инкубации неразрушенные

«слетки и клеточные обмотки осаждают цен трифугированием. 0,1 мл надосадочной 10 кидкости анализируют на содержание вышедшего из клеток люминесцентных бакте рий фермента люциферазы по люминесцеитной реакции 1п vitrp.

Количество вышедшей люциферазы при 15 действии бутилметакрилата в дозе 1 мМ было минимально(0,23 усл.ед. и 0,03) и значительно не отличалось от контроля. При дозе . 2 мМ количество люциферазы составило

1,05 и 0,08 усл,ед., что достоверно отлича- 20 лось от контроля (Р < 0,01). Полученные, данные говорят, что порог мембранотоксического действия бутилметакрилата равен 2 мМ.

П р и м е о 2. Определение 50 мембра- 25 нолитической дозы (ЕДщ). Суспензию культуры рйЛ е!одпаФ1 разливают в дублях в ряд пробирок по 1 мл. В обе пробирки дубля приливают по 10 мкл определенной концентрации ксенобиотика. В данном случае это 30 спиртовый раствор бутилакрилата в конечных концентрациях 4; 8; 16; 32; 64 мМ. В ,,качестве первого контроля полного лизиса ,, клеток к 1 мл культуры бактерий приливают, мембранотропный антибиотик, не действу- 35 ,ющий на люминесцентную систему, пол,имиксин, в конечной концентрации 100

,ед/мл. Вторым контролем на исследование . тушения люминесценции непосредственно тестируемыми концентрациями ксенобио- 40 тика служат дублирующие пробирки с ксенобиотиком и культурой офотобактерий, в которые добавляют полимиксин в конечной концентрации 100 ед/мл. Контрольные и опытные пробы инкубируют 5 мин при 28 С, 45 центрифугированием осаждают клетки и клеточные обломки и О, I мл. надосадочной . жидкости исследуют на содержание люциферазы по люминесцентной реакции in

vitro.

Результаты исследования 50 мембранолитической дозы для бутилакрилата представлены в табл.1.

По полученным результатам исследования вычисление истинных значений количества вышедшей из клеток люциферазы, т.е. с учетом ингибирования люминесцентной системы непосредственно ксенобиотиком, проводят следующим образом. Свечение опытных проб умножают на коэффициент ингибирования, равный отношению контроль 1/контроль 2. Для бутилакрилата вычисляют определенные значения. Из вычисленных значений рассчитывают 50 мембранолитическую дозу (ЕД о). Вычисленная Ega для бутилакрилата = 7,4 мм (табл.2).

Определенное значение ЕДцо для бутилакрилата по прототипу составило 12 мМ.

Пример 3. При сравнении времени экспозиции фотобактерий с .бутилакрилатом в концентрации 7,4 мМ со временем экспозиции эритроцитов с тем же веществом в концентрации 12 мМ установлено, что в первом случае максимальный эффект достигается за 5 мин, тогда как во втором максимальный выход гемоглобина из зритроцитов достигается за 45 мин.

Таким образом время определения мембранотоксического действия химических веществ значительно сокращается.

Формула изобретения

Способ определения мембранотоксического действия химических веществ, включающий инкубацию индикаторных клеток с исследуемыми химическими веществами, центрифугирование и определение количества освободившегося внутриклеточного содержимого по появлению в супернатанте маркерного белка, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, индикаторными клетками служат люминесцентные бактерии, а в качестве маркерного белка используют люциферазу и определяют ее активность в супернатанте.

1659851

Таблица 1

Таблица 2

Составитель А.Скурат

Техред M.Ìîðãåíòàë

Редактор А.Долинич

Корректор Т.Малец

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 1839 Тираж 420 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35. Раушская наб., 4/5