Способ определения карфедона в плазме крови

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения карфедона в плазме крови. Целью изобретения является повышение специфичности и чувствительности способа, что достигается тем, что анализируемую пробу обрабатывают хлороформом в соотношении 1:40, экстрагируют , упаривают, остаток растворяют в 0,1%-ном хлороформном растворе 2, 4, 5, 7, 8, 10-гексаметил-2,4,8,10-тетраазабицикло (4.4.0) декандионэ-3,9 и хроматографируют на набивной колонке с фазой 5% ОУ-17 на инертоне супер (0.16-0,20 мм) при температуре колонки 240°С, температуре испарителя 300°С и скорости газа носителя 35 мл/мин. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N 33/50

ГОСУДАРСТВЕ ННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ пРМ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ аюй (21) 4636317/14 (22) 12,01.89 (46) 30.06.91. Бюл. М 24 (71) Московский медицинский стоматологический -институт им. Н,А.Семашко (72) А.С.Берлянд, С,С.Спектор, А.З.Книжник, А.А.Прокопов и А.В,Крохин (53) 612.015(088.8) (56) Государственная фармакопея, т.Х, с.756, 766, 1968. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАРФЕДОНА

В ПЛАЗМЕ КРОВИ (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения

Изобретение относится к медицине, а именно к способам определения лекарств в биологических жидкостях, Цель изобретения — повышение специфичности и чувствительности способа.

Цель достигается тем, что анализируемую пробу обрабатывают хлороформом при соотношении 1:40, хлороформный экстракт упаривают досуха. К сухому остатку добавляют 0,1%-ный хлороформный раствор внугреннего стандарта 2,4,5,7,8,10 — гексаметил-2,4,8,10-тетрааза бици кло(4,4,0)декандион-3,9 (ГТД) и вводят в хроматограф при температуре испарителя 300 С и темпе ратуре колонки 240 С, заполненной фенилметилсиликоном-5%0Y-17 на инертоне супер (0,16-0,20 мм).

Попытка использовать в качестве экстрагента другие низкокипящие растворители, такие как серный эфир, пентан, гексан, этилацетат, не увенчалась успехом, так как карфедон в них практически нерастворим... Ы,, 1659854 А1 карфедона в плазме крови. Целью изобретения является повышение специфичности и чувствительности способа, что достигается тем, что анализируемую пробу обрабатывают хлороформом в соотношении 1:40, экстрагируют, упаривают, остаток растворяют в 0,1%-ном хлороформном растворе 2. 4, 5, 7, 8, 10-гексаметил-2,4,8,10-тетраазабицикло (4.4.0) декандиона-3,9 и хроматографируют на набивной колонке с фазой 5% ОУ-17 на инертоне супер (0,16 — 0,20 мм) при температуре колонки 240 С, температуре испарителя 300 С и скорости газа носителя 35 мл/мин. 3 табл, Использование в качестве внутреннего стандарта других веществ, таких как пирацетам, который по химической структуре близок к карфедону, было безуспешным;так как в укаэанных условиях на хроматограмме пик его накладывается на пики эндогенных ЯЬ, веществ. Q3

Снижение температуры колонки и испа- 0 рителя ниже вышеуказанной резко снижало, gy чувствительность способа, а увеличение у температуры вышеуказанного интервала приводило к снижению селективности способа, так как пик карфедона накладывался на пики эндогенов.

Разделяемая способность системы была оптимальна на колонке ОУ-17, фирмы

Chemapot о.п. Лахема Брно, так как использование других фаз, таких как Апиезон 1, SP-2100, $Е-30 приводило к изменению симметричности пика карфедона, вносило дополнительные трудности с временем удержания, что приводило к снижению чувствительности и селективности способа.

Предлагаемый способ позволяет повысить селективность определения карфедона, увеличить чувствительность до МКГ количеств.

Способ осуществляют следующим образом, Для нахождения относительных калибровочных коэффициентов карфедона по

ГТД готовят смеси с точно известным содержанием карфедона и внутреннего стандарта в соотношениях 1:1, 2:1; 3:1; 1:2; 1:3 и хроматографируют в указанных условиях на хроматографе ЛХМ-80 в изометрическом режиме на колонке длиной 1 м, детектор плазменно-ионизацtëoííûé, скорость ленты самописца 200 мм/ч.

Сигнал детектора является линейным по отношению к обоим определяемым веществам при данных соотношениях. . В качестве параметра для расчета пиков используют площадь пикса (1В), которую рассчитывают как произведение высоты пика на ширину его на половине высоты.

Относительный калибровочный коэффициент оказался равным 1,015. Относительная ошибка определения по данным анализа калибровочных смесей составляет M,64% (n-7, Р-0,99).

Пример 1. Количественное определеwe карфедона в моче крыс (модельные растворы).

Готовят точные растворы карфедона в моче в концентрациях, указанных в табл.1.

1 мл приготовленной искусственной смеси помещают в цилиндр, объемом 60 мл, с притертой пробкой, добавляют 40 мл хлороформа и встряхивают на шейкере в течение 20 мин. После экстра гирования цилиндр помещают в морозильную камеру с температурой -15ОC.

Водный слой замерзает, а хлороформный слой отбирают и помещают в другой цилиндр, после чего экстракт упаривают на роторном испарителе до объема 1 — 2 мл. Остаток количественно переносят в микропробирку с дном, оттянутым в капилляр, и упаривают досуха в токе азота.

К сухому остатку добавляют соответствующее количество 0,1%-ного раствора ГГД в хлороформе. 1 — 2 мкл полученного раствора вводят микрошприцем в испаритель хроматографа (температура испарителя 300 С, температура колонки 240ОС), Время удерживания карфедона 8 25, время удерживаIô -n ния ГТД 5 35".

Измеряют соотношение площадей пиков карфедона и внутреннего стандарта. Со25 шейкере в течение 20 мин. После перемеши(5

20 держание карфедона вычисляют по формуле

Д= X К1/s Q, где А — содержание карфедона в микрограммах;

Х вЂ” отношение площадей пиков карфедона и ГТД;

Ki/s — относительный калибровочный коэффициент;

Q — количество добавленного внутреннего стандарта, Результаты определения карфедона в моче (модельные растворы) представлены в табл,1.

Пример 2. Количественное определение карфедона в плазме крови (модельные растворы). Плазму крыс получают центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об/мин. Готовят точные растворы карфедона в плазме крови в концентрациях, указанных в табл.2, 1 мл приготовленного модельного раствора помещают в цилиндр объемом 60 мл с притертой пробкой, добавляют 40 мл хлороформа и перемешивают на вания поступают аналогично примеру 1.

Результаты количественного определе ния карфедона в плазме крови (модельные растворы) приведены в табл.2.

Пример 3, КоличЕвтвенное определение карфедона в плазме крови крыс при внутримышечном введении карфедона в дозе 100 мг/кг, Отбирают кровь крыс-самцов до введения карфедона (контроль) и в течение 8 ч через определенные интервалы времени после внутримышечного введения карфедана.

Кровь крыс центрифугируют в течение

10 мин при 3000 об/мин. 1 мл полученной плазмы помещают в цилиндр (Ч=60 мл) с притертой пробкой, добавляют 40 мл хлороформа, перемешивают в шейкере в течение

20 мин, далее поступают аналогично примеру 1, Результаты определения карфедона в плазме крови крыс при внутримышечном введении приведены в табл.3.

Из таблицы видно, что предлагаемый способ, учитывая индивидуальные особенности животных, позволяет надежно и достоверно определять среднее содержание карфедона s плазме крови крыс в различные интервалы времени после его введения, Формула изобретения

Способ определения карфедона в плазме крови путем обработки пробы. с последующим измерением, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности и чувствительности способа, пробу об1659854 путем введения полученного раствора в колонку, содержащую в качестве неподвижной фазы 5 ОУ-17 на инертоне супер (0,16 — 0,20 мм) при температуре колонки и испарителя 240 и 300 С соответственно и скорости газа носителя азота 35 мл/мин. рабатывают хлороформом в соотношении

1:40, хлороформный экстракт упаривают, растворяют в 0,1 -ном хлороформном растворе 2,4,5.7,8,10-гексаметил-2,4,8,10-тетраазабицикло (4.4.0)декандиона-3,9. а 5 измерение проводят хроматографически

Таблица 1

Метрологические характеристики (при

n = 5, P = 0,95) йдено карфедона, мкг %

92,63 92,63

46,86 . 93,72

100

Ь = 2,72

Sx = 1,25

Б» = 2,62

10

8,93 89,30

Таблица 2

Метрологические характеристики (при .и = 5, Р = 0 95) Найдено карфедона мкг 100

1,27

Еос = 2,93 А = 13к57%

8»- = .2,04

E = 4,71

А =. +5,96Х

$» = 1,67

Е,1 = 3,1 5 . А = 14,12%

Таблица 3

Время с момента введения карфедона, мин держание азмн> мкг етрологические харакеристики (при Р 0>95) меренное

Х-9З5

9,77

9, 14

10, 25

9 53

8,06

S -037

8-1,17 .а +12,51»

9,35 зз,,зз. З1,21.

32» 1!

30,43

32>49

Х 31,91

Бк 0,51

1,60 а + 5,032

31,91 зо

Х - 40,68

- O,94

40>68

8 2,98

4 7,332

Х 49>24

49, 19

С одержани карфед она в1мл. мочи мкг.Содержание карфедона в1мл плазмы, NKI

85,96,85,06

42,25, 84,50

8,19 8I>90

4О,З4

37,66

40, 13

42,25.

4Э,04

Е = 8,65

Е = 3,96

Е,7. = 6,41

А = +9,33%

А = -4 73%

А = 29,25Х

Продолжение табл. 3 з

50, 62

Бх 1,40

Е 4,45

А = +9,038

50,49

43,94

49,24

51,97

53,20

56,20

Х = 51,13

Бх 2,11

Е= 6,71

А = «"13,13Х

54, 03

46, 63

45,63 56,04

49,28

50,55

56,57

47;10

51,06

50,10

51,13

Х = 51,90

S- = 1,aS

Е = 5,98

А +11,522

51,90

Х = 51,73

Бх = 0,37

Е = 1,!8

А = .2,292

120

51, 69

53,02

51,73

51,97

31,91

30,94

Х = 32,20

Бх = 0,797

Е = 2,53

А = +7,747.

240

34,90

30 39

32,84

32,20

11,97

Х = 10,65

Бх 1,06

Е 3,36

А = л31,55Х!

0,31

8,13

8,87

480

10,65

13,97

Составитель А.дгуреев

Техред M.Моргентал Корректор И.Муска

Редактор А.Долинич

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 1839 . Тираж 42О Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5