Способ распознавания белков

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к биохимическим исследованиям . Целью изобретения является расширение функциональных возможностей и повышение точности исследований за счет увеличения информативности. Способ состоит в том, что вычисляют среднюю гидрофобность в калориях на остаток с учетом констант для боковых групп аминокислот, определенных для переходов этанол - вода и М-циклогексил-2-пирролидон - вода, рассчитывают коэффициенты корреляции между гидрофобностью и содержанием аминокислот, по которым устанавливают принадлежность к тому или иному классу белков.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (s1)s G 01 N 33/68, ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4641911/13 (22) 19.12.88 (46) 30.06.91. Бюл. ¹ 24 (71) Казахский научно-исследовательский институт земледелия им. B.Р.Вильямса (72) И.M.Ñàâè÷ (53) 575.2.581.19(088,8) (56) Калинников Д,д., Камышова Т.В. Содержание и коррелятивные связи между аминокислотами зеина, Физиология и биохимия культурных растений, 1984, т.16, № 1. (54) СПОСОБ РАСПОЗНАВАНИЯ БЕЛКОВ (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к биохимическим исследоИзобретение относится к области физико-химической биологии и биотехнологии, а именно к биологической химии, молекулярной биологии, биоорганической химии, и может быть использовано научными учреждениями при изучении физико-химических свойств белков и полипептидов.

Целью предлагаемого изобретения является расширение функциональных возможностей и повышение точности исследований за счет увеличения информативности.

Способ состоит в том, что вычисляют среднюю гидрофобность белков с учетом констант для боковых групп аминокислот; определенных при переходе этанол — вода и й-циклогексил-2-пирролидон — вода. После этого находят коэффициенты корреляции между содержанием аминокислот и гидрофобностью и по этим значениям определяют принадлежность белков к тому или иному классу (фракции). ваниям, Целью изобретения является расширение функциональных возможностей и повышение точности исследований за счет увеличения информативности. Способ состоит в том, что вычисляют среднюю гидрофобность в калориях на остаток с учетом констант для боковых групп аминокислот, определенных для переходов этанол — вода и N-циклогексил-2-пирролидон — вода, рассчитывают коэффициенты корреляции между гидрофобностью и содержанием аминокислот, па которым устанавливают принадлежность к тому или иному классу белков, Пример 1. Берется не менее 10 Я различных самоопыленных линий кукурузы, Из зерен каждой линии удаляют зародыши, эндосперм размалывают до тонкого порошка, отвешивают 10 г муки, приливают 100 мл О

70 -ного этанола, содержащего 2 М моче- (Л . вины, и помещают на водяную баню на I ч.

После этого суспензию центрифуги руют при р

70009 в течение 15 мин. Надосадочную жидкость упаривают под феном до 1/5-1/7 первоначального объема и используют для електрофоретичеокогр резделенил оелкое е

10 -ном полиекрилемидном геле (ПААГт, содержащего 8 М мочевины. После завершения электрофореза гели опускают на короткое время в 10 -ный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ), после чего из геля вырезают участки с опалесцирующими белковыми зонами, их гомогенизируют с

2 обьемами 0,1 н.раствора NaOH. Затем гел ь осажда ют центрифуги рова нием, а к надосадочной жидкости приливают равный .

1659860

10 l5

26

25 обьем 40 Р (ТХУ), и белок осаждают центрифугированием при 56090g 20 мин. После этого белок суспендируют в 6 н. HCI, запаивают в ампулы и помещак)т для гидролиэа при 110ОС в течение 22 ч. Полученный гидролиэат анализируют на наличие аминокислот на аминокислотном анализаторе и вычисляют аминокислотнь1й состав, Далее содержание каждой аминокислоты умножают на соответствующие константы, определенные для перехода этанол — вода, й-циклогексил-2-пирролидон — вода (данные по А-субфракции проламина в табл.1).

Затем суммируют полученные значения и делят на 100 (поскольку расчет велся изначально в молярных Я Тем самым находят среднюю гидрофобность данного белка.

Аналогичную операцию проводят со всеми самоопыленными линиями кукурузы, Для того чтобы уд@стовер п ься, что выделенные белки Являются npoлэ."4инами, рассчитывают коэффициенты корреляции между средней гидрофобн остью и глицином, феиилалеиином также между треонином— глицином, глутаминовой кислотой, пролином, лизином, аргинином и гдицином. ПроВодят сравнение полученных коэффициентов корреляции с табличными для данной культу ры (тэбл,2). 6 сйучае совЙЗДВиия знаков и цифр а пределах ж 16$ следует считать этот белок проламинои.

Пример 2. Берут зрелое зерна не

Вмиее 10 линий кукуру"3ы. Иэ щден удаля4ОТ

36136дыш и эйдос пкрм, иФмэлмвают до тон" кого порошка, к 16 г муки г рияивают 100 мл

О.6%-ного додецилсульфата Ка(ДДСЬ}а), приготовленного на ОЯ5 Ч Иа-фосфатном буф6ре, рН 7,0, и стае Ят на магнитную мешалку на 1 ч, затем цеитрифугиру1ат при

7ОООЯ в течение 15 мин. НВДОсадочную жидкость удаляют, а осадок заливают 20 мл

1,Щ ДДСИа на .к м же буфере и экстрагируют белок при энергичном помешивании в течение 0,5 ч. Суспензию центрифугируют при 70009 15 мин. Сулернатант сливают, к нему прилива!от этанол до 750 концентрации и выдерживают в холодильнике 0,6 ч.

После центрифугирования осадок анализируют на содержание аминокислот как описано в примере 1. Дальнеишие этапы

Расчета описаны и примере 1 и даны в табл.1 для глютелина, Расчет коэффициентов корреляции осуществляют между значениями средней гидрофобности и глутаминовой кислотой, пролином, глицином, фенилаланином, лейцином, а также между парами аминокислот; аспарагиновой — глутаминовой, глицином — фенилаланином; лизином— аргинином, лизином-аспарагиновой кислотой, треонином — глицином, треонином— фенилаланином, Проводят сравнение полученных коэффициентов корреляции с табличными для данной культуры (табл.3). В случае совпадения знаков и цифр в предепах „10$ следует считать этот белок глютелином.

Пример 3. Зрелое зерно не менее 10 сортов пшеницы размалывают до тонкого порошка. Отвешивают 1 г муки, приливают

10 мл 1 М МаО и выдерживают в холодильнике в течение 1 ч с периодическим помешиванием. Центрифугируют при 7000g в течение,15 мин. 8 насдосадной жидкости определяют аминокислотныи состав со всеми дальнейшими операциями, описанными в примере 1. Проводят сравнение полученных коэффициентов корреляции с табличными данными для пшеницы (табл.2). В случае совпадения цифр в пределах - 10 Д, следует считать этот белок альбумино-глобулиновой фракцией.

Как следует из табл.2. 3 и 4, эталонные коэффициенты корреляции для распоэнава-.

ИИя белков являются общими в onpeäåëåíных пределах для всего семейства злаковых, в крайнем случае ограничиваются рамками вида (табл.5 и 6). Поэтому информ8ция а конкретных сортах или линиях исследуемых растений не имеет значения

Формула изобретения

Способ распознавания белков, включающий аминокислотный анализ белковой пробы и расчет коэффициентов корреляции ежду аминокислотами, отл ич а ю щи йс я тем, что, с целью расширения функциональных возможностей и повышения точности исследований за счет увеличения информативности, в белковой Мробе дополнительно вь1числяют среднюю гидрофобность, используя константы для боковых групп аминокислот, определенные для переходов этанол — вода и И-циклогексил-2пирролидон — вода, определяют коэффициенты корреляции между гидрофобностью и содержанием аминокислот, по которым устанавливают принадлежность белков к тому или иному классу. !669860 л о

Ch ф °

СЧ СЧ

0Ъ О о

CO

СЧ О

СО сч

Ch о

I an

ГЪ 0Ъ аа Ф л съ

Со л

СО иЪ

01 л

Со О

О СГЪ

С 4

СЧ С Ъ

Л Г а а ОЪ

an e

О Ъ О

Ф Ю 1О

N. °

C) о

СЧ О о

CO CO

ГЪ л т 0Ъ

СЧ О

1О

0Ъ

ЧЪ

0Ъ иЪ о л л

ОЪ

О Со

0Ъ Ch я

О

k( о

v сс\ л

СГЪ

an л

СО

С0

ЪО

Ю л

СГЪ

1 л

an

О

СО

3/4

0Ъ an

СЪ ъ о

1О I O

° ГЪ

00 о

СЧ о о о а сч о

СЧ л

Ю л

СО

О1

6 я

Й!! I Х

I I » i.. й! и ! Б

С Ъ

Ю

Г

0Ъ сч

СО

СО

1О СЧ

4 л о о о сч

ЧЪ ЧЭ л

44Ъ

an Ch

СЧ

Ю с Ъ

1 0Ъ

ОЪ в 00

С Ъ

СГЪ сч о сО !

СГЪ о

СЧ Ch

ОЪ

СЧ

Ф

СЧ СЧ е СО

С Ъ 00

Ф

С 4

О а

Ch

СЪ

an

Ch

I I О

О СГЪ сч сч

ГГЪ ОЪ О О, СЧ aC4 Оа

С Ъ I ОЪ -Ф Ч>

1 Ъ О л

1 О

О an

° е

СО О

00 Ф

Ф Оъ

СЧ ООЪ

1 1 40 аЮ

I3 о х !

Б" 8! 2

I 1 QСГ

Й f 05

D о съ о — о

СГЪ Л СЧ о о

an иЪ

С"Ъ

Гх

Ц о

0l

1 40

Ц Г

О 04

Х 0ЕЛ а0 М ЧЪ

& ФФОЪ о о о

ГГЪ СГЪ ь

МЪ

I и

v o х о(!»

ГО 1 E 1 л

СЧ о л а

Ю

О О Ch Г

° О СЪ О о

ССГ СЧ N

an

СО СЧ

Ф ф

N O

СЧ е о

Сф ° м

ОЪ

О 00

СЪ

СФЪ о с а

Ф я

С, 1

CC

04

9) о м» а °

Л СГ

N а»

° Ф СГЪ %О сО

В Л СГ

° a СЧ а с

° ч» СЧ СЧ

Ф

С С Ъ

С Ъ о е сч О

О Г О

n a> а h ° О N

СЧ

Г/Ъ о о (Ъ CO

В 4Ь ф Ф» о х х

04 О

Д СГ

< 1-4

lC с0

l0 о

Х 44 х

Р

04 Ц и

"и. е 2 Л Ф о х

И а и а0

m )

"! ю

«х о х

6

5! ) ! p

О у

=I и..

1 04

Г х

1 &

1 ааа я о о о о о о сч ъ о

00 Π— О N О О О

I w an 0o an О О

D . О О О О О

D О О ГГЪ О an сГЪ сО an л в w со О

N I Л a» N СЧ N N! C4

1:!

04аО Р, ! йх6

IV4C:

1659860!

I о! !

« I

C)i !

О Ъ РЪ л Фс о « ! о.4 СЧ О ) Ch е «л с о о с6

as

К

I М

СО Ф л Ч

Ю

« о

00 in О сО л «л о о о

CD л о

r О 3 1О

«а « о о с

С Ъ о ж1

Qs

I — "1

1 ю4

CI! р

oas l css

:I

Ц III ьо Р с> и

«Q0

CD л о

Ch 3 3 .

CO О л «« о о о ( ( (8р (ч N in

Ch б сО а л л о о о бЪ; е-

v v o

О О Х а К

П Р, I I х х g

Ф о р

М H

i и

I . .csI х -.

5 х

Ф 4 о

О V Е

asO О ж х е х ц Г

ss, as v

scs o о х

I Х Ю

Г-ю

\(\ ф х

os ф! !

=! о О Е1 О 00

«СЯ е CD « о о о и . о с1 О «Ch б л О л л о о о 3 б 00 СЧ СЧ

Оо л О е «

О CD CD

О О

<ч л л О л о о о о

О С" Ch Ю Ю е е М 1О е ф о -.-о л о о о о!

» о

Х ф М х

А De

v о л х е

so v о о

Цз

g, О

О 1:»

I 9.

СЪ

А «»

v о л х (ч е v о о

gя х

С ф! ее » о

5 Р

so as д

О О, Гч

;т g CV р.о х q и

Я И

1:(Ф х цо

А Х 2 эа5

tf Ф

1659860

Таблица 3

Коэффициенты корреляции между аминокислотами и средней гндрофобностью пролемннов зерна

Вн

Признак д растения пшеница ячмень рис кукуруза сорго

-0,25

Глутаминоваякислотапролнн

-0,45

Лизин - аргнннн

Лизин - глнцнн

О, 17

0,60

Табли ца 4.

Коэффициенты корреляции меиду аминокислотами и средней гндрофобностьв глютелинов зерна

Вид растения ячмень

Признак рис, ysa сорго шеница

Глутамииовая кислота— гидрофобность (Ц) 0,31

О;74

0,78

0,37

0,10

Пролин - гидрофобность (Ц)

Глицин - гидрофобность (Э) 0,96

-0,66

-0,74

-0,88

-О, 70

-О, 56

Глицин - гидрофобиость (Ц) -0,73

Фенилаланин - гидрофобность (Э) О, 31

0,81

0,56

0 53

0,74

0,80

0,31

0,91

0,57

Лейцин -. гидрофобность (Э) 0,47

Аспарагиновая,- глутаминовая кислота

-0,34

-0,56

-0,86

-0,64

Глицин - фенилаланин

0,58

О, 7.1

Лизин - аргииин

Лизин - аспарагиновая кислота

0,19

0,52

0,74

-0,48

0,56

Треонин - глицин

-О, 20

Треонин - фенилаланин

Глутвююнова» кислотаглицин

-0,60

-0,43

-0,42

0924

-0,15

-Оэ 95

0,31

0,49

0,52

0,44

Валин - лизин

Глутаминовая кислотаизолейцин

-О 87

-О 43

-0,57

-0,45

-0,63

Глицин - гндрофобность (Ц)

Феннлеланин - гндрофобность (П) феннлеланин - гидрофобность (Э)

Треонин - глицнн

О,!4

0,10

0,89

-0,79

0I46

0,44

-О 83

0,77

0,62

0,59

-0,85

0,86

0,67

0,93

0,85

"0,62

-0,91

-0,74

-0,86

О 15

0,7!

0,85

-0,81

-0,65

0,31

0,77

0,34

-0,60

-О, 56

0,51

0,54

0,82

-0,56

"01 77С

0,64

0,81

0,80

-0,26

0,24

0,46

-0,40

-0,76

0,53

0,43

0,24

-О, 13

-О, 63

0,48

0,53

0,81

-О, 76

0,40

О, 89

0,74

0,80

-О, 26

-О, 18

1659860

Признак

Белок глютелинового типа с высоким содержанием пролина

Пр олин — гидрофобность (Э)

Аспарагиновая кислота — пролин

Аспарагиновая кислота — валин

Аспарагиновая кислота - феннлаланин

Треонин - серии

Треонин - лейцин

Пролин - фенилаланин

Алании - валин

Алании — лейцин

Валин — фенилал анин

Валин - гистидин

Изолейцин " лизин

Тирозин — гистидин

0,83

-0,79

-0,75

0,70

0,76

-О, 65

-О, 69 -О, 67

0,81

-Оэ.71

0 62

0,68

-О, 69.

-О, 66, Тирозин -- аргинин

Белок глютелинового типа с повышенным серина и глицина содержанием

Пролин — гидрофобность (Э)

Треонин - алании

Треонин — валин

Глутаминовая кислота — валин

0,72

-О, 64

-0,77

-О, 63

0,63

Глутаминовая кислота - лейцин

-0,81

-О, 69 Глутаминовая кислота - лизин

Глицин - лейцин

Глицин - гидрофобность (Ц)

Валин — гидрафобность (Э)

Валин — лизин

-0,83

0,63

0,60

Таблица 5

Коэффициенты корреляции между аминокислотами и гидрофобностью специфических белков зерна кукурузы

1659860

Та блица 6

Коэффициенты корредяцни между аминокислотавщ и средней гидрофобностью высокомолекулярного глютелина зерна пшеницы

Признак

Валин - гидрофобность (Э)

Фенилаланин — гидрофобность (3) 0,80

0,62

-0,62

-0,89

0,65

-0,7а

Составитель ВДемкин

Редактор А.Долинич Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор И.Муска

Заказ 1839 Тираж 416 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент". г. Ужгород, ул.Гагарина. 101 лутаминовая кислота - гидрофобность (Ц)

Пролии - гндрофобность (Ц) Треонин — тирозин

Изолейцин — гидрофобность (Э)

Изолейцин - лейцин

Изолейцин - тирозин

Лейцин - тирозин

Лейцин — фенилаланин

Тироовин — фенилаланин

0,72

0,68

0,72

0,69

0971