Способ моделирования дыхательной вспышки полиморфоядерных лейкоцитов

 

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОбРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4497980! 14 (22) 25.10.88 (46) 23.04.91. Бюл. N 15 (71) Институт химической физики АН СССР (72) А.Р Монастырская, В.M.Ôðîëîâà, В.В.Роговин, В,К.Дейгин, А,П.Востряков и В.А.Горбатов (53) 612.615(688,8) (56) Sraitk RJ., Wierenza Nf., 1оеп S,S.

InfIarnmavоп, 1980, v. 4, р. 73. (54) СПОСОБ МОД :ЛИРОВАН "Я ".jÜ <ÀТЕЛЬНОЙ ВСПЫШгИ ПОЛИМОРФОЯДЕРНЫХ ЛЕЙКОЦИ ГОВ (57) Изобретение относится к фармакологии и биохимии и может быть использовано для моделирования дыхательной вспышки полиморфоядерных лейкоцитов. Цель изобреИзобретение относится к фармакологии и биохимии и может быть использовано для моделирования дыхательной вспышки полиморфоядерных лейкоцитов (ПМЯЛ), Цель изобретения — упрощение ñïîñîба.

Способ осуществляется следующим образом.

В цельную кровь, разбавленную физиологическим раствором в соотношении 1:9, добавляют следующие пептидные препараты: даларгин (тироэил-0-аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинин) в концентрации

10 -10 М, тимоген (1 -глутамид-1-триптофан) в концентрации 10 — 10 М, гликопептид (N-ацвтил-глюкозами нил-N-а цетил-мурамилL-аланил-0-изоглутамин) в концентрации

10 — 10 М, гексапептид (аргинил-лиэил-глутамил-валил-тирозил-аргинин) в концентра„„5U„„1644206 А1 (s»s G 09 В 23/28, 6 01 и 33!68 тения — упрощение способа за счет сокрашения числа трудоемких операций. Предложение состоит в том, что при моделировании дыхательной вспышки в качестве источника лейкоцитов используют цельную кровь, а регистрацию люминол-зависимой хемилюминесценции проводят в присутствии пептидов тирозил-О-аланилз глицил-фенилаланил-лейцил-аргинина 10

10 М, 1 -глутамил -три птофана 10 — 10 М, -5 а 7 й-а цетил-гл ю коза мин ил-К-а цетил-мура11171-1 -аланил-D-и -orfiyTav. 1Ha 10 — 10 М или аргинил-лиэил-глутамил-вамил-тирозил-аогинина "0 — 10 М. Изобретение по-11 зволяет упростить способ за счет сокращения операций по обработке крови и использования доступных препаратов. 1 табл. ции 10 — 10 М, используя всякий раэ свеже-11 -Б приготовленный раствор, Разведения и последующие измерения проводят в полистиреновых кюветах, что исключает возможность прилипания пептидов к стенкам сосудов, увеличивает точность измерения, Максимальные значения хемилюминесценции цел ьной крови определяют в спо-! ъ койном состоянии лейкоцитов и после: ь индукции фагоцитоза добавлением полистиренового латекса диаметром 0,82 мкм (4 10

7 на кювету), Измерения проводят налюминометре. Для усиления хемилюминесценции (XJi) используют люминол (б-аина-2,3 дигндро-1,4-фталаэиндион, Серва), предварительно разведенный в физиологи(acKQM растворе с добавкой тризтанола 1и;:.а в кои1644206 центрации 9 мкмlмл. Конечная концентрация люминола в кювете составляет 10 М.

Регистрируют интегрированный сигнал

XJl за 10 с в сериях опытов со спонтанной и индуцированной фагоцитозом ХЛ при добавлении в кюветы растворов пептидных препаратов изученных концентраций, Измерения проводят в трипликатах образцов.

Результаты измерений анализируют по максимальным значениям интегрированного сигнала в сериях экспериментов по каждой концентрации каждого пептидного препарата (ХЛэ п) и в контрольных образцах, куда добавляют эквивалентное количество физиологического раствора без пептида (ХЛ контр.)

Затем вычисляют изменения ХЛ = ХЛэксп.—

Xllyggyp. при всех изученных концентрациях взятых для изучения пептидных препаратов в покое и при фагоцитозе.

Пример. В цельную кровь 20 белых мышей, беспородных самцов весом 18 — 20 r, половозрелых, предварительно собранную в общую гепаринизированную емкость и затем помещенную в полистиреновые кюветы с физиологическим раствором в соотношении 1:9, добавляют тимоген в концентрации

10-а М

Для измерения ХЛ используют 4 трипликата образцов: с концентрацией тимогена

10 M в кювете с латексом для фагоцитоза, с концентрацией тимогена 10 М в кювете с физиологическим раствором, с цельной кровью без тимогена с латексом для фагоцитоза и с цельной кровью без тимогена и без латекса с физиологическим раствором.

Измерения в таких трипликатах проводят одновременно после одновременной инкубации в течение 10 мин при 37"С. Измерения фиксируют один раз в 10 мин до резкого уменьшения интенсивности ХЛ и отбирают максимальный результат.

Это и есть максимальный показатель интегрированного сигнала ХЛ за 10 с. Одновременно измеряют фоновую ХЛ, для чего перед началом измерений образуов измеряют ХЛ пустой (бланковой) кюветы, значение которой в дальнейших измерениях автоматически вычитается из измеренных значений ХЛ изучаемых образцов.

После подготовки образцов к измерению (помещение в кюветы цельной крови с физиологическим раствором 1:9, добавление тимогена 10 8 M в кювету или аналогичного объема физиологического раствора), заполняют диспенсер латексом и отдельно физиологическим раствором, затем добавляют во все, кроме бланковой кюветы, люминол в концентрации 10 M в кювете и инкубируют образцы 10 мин при 37 С. Затем измеряют ХЛ всех образцов, с помои ью диспенсеров добавляют латекс по 4 10 на кювету или соответственно тот же объем физиологического раствора в те образцы, 5 куда не следует добавлять латекс. Записывают значения ХЛ, индуцированной латексом (при фагоцитозе), и неиндуцированной в кюветах, где нет латекса.

Запись значений продолжается до до10 стижения низких значений ХЛ (в течение часа), Величина прироста ХЛ составляет

262 j(,.

Описанным способом проведены изме-

15 рения уровня ХЛ и при других концентрациях тимогена, пептида и других.

Данные представлены в таблице.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает в сравнении с известным уп20 рощение за счетсокращения числа трудоемких операций по обработке крови путем использования цельной крови и замены дорогостоящего импортного пептидного фактора значительно более дешевыми

25 пептидными препаратами при одновременном повышении специфичности способа, так как применение впервые пептидного фактора после добавления корпускулярного стимула обнаружило добавочный однонап30 равленный эффект от применения обоих стимулов, что позволяет усилить ХЛ при добавлении корпускулярного стимула, при надобности по ходу эксперимента, дополнительно усилить ХЛ внесением рас35 .творимого стимула из числа предложенных пептидных факторов.

Формула изобретения

Способ моделирования дыхательной

40, вспышки полиморфоядерных лейкоцитов путем обработки полииорфоядерных лейкоцитов активаторами дыхательной вспышки и пептидными факторами с последующей регистрацией интенсивно45 сти дыхательной вспышки по уровню люминол-зависимой хемилюминесценции, о тличающийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве источника полиморфоядерных лейкоцитов используют

50 цельную кровь, а в качестве пептидных факторов — тирозил-D-аланил-глицил-фенилалиллейцил-аргинин в концентрации 10 -10 М,, 1=гл7утамил-1=триптофан в концентрации 10

-9

10 М, N-ацетил-глюкозаминил-й-ацетил55 мурамил- .-алан ил-D-изоглутамин в концентрации 10 -10 5 M или аргиниллизил-глутамил-валил-тирозил-аргинин в концентрации 10 "-10 5 М, 1644206

Составитель Н.Гуляева

Техред М.Моргентал Корректор Т.Палий

Редактор Н.Бобкова

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 1243 Тираж 317 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5