Способ иммунологической диагностики туберкулеза

 

Изобретение относится к медицине, а именно к методам иммунодиагностики туберкулеза. Цель изобретения - повышение точности способа. Предварительно из туберкулезного микроба (штамм БЦж) выделяют гликопротеид, который используют в качестве антигена. У больного берут кровь, выделяют сыворотку, которую разводят 1:200 и вносят в микроячейки плата, сенсибилизированные антигеном, параллельно с разведенной сывороткой здоровых. После чего проводят иммуноферментный анализ и определяют оптическую плотность в обеих пробах и при увеличении ее значения в пробе с сывороткой крови больного по сравнению с пробой с сывороткой здоровых более чем на 0,2 единицы диагностируют туберкулез. Достигается увеличение точности на 4%.

СОЮЗ С08ЕTCKVIX

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (sI)s G 01 N 33/535

ГОСУДАРСТ8ЕННЫИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4470498/14 (22) 22.08.88 (46) 23.08.91. Бюл. М 31 (71) Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза (72) P.Þ.Ðoìàíoâà, В.Я.Гергерт и К.М.Бугрова (53) 615,375 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР по заявке М 4286888. 11.05.87. (54) СПОСОБ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА (57) Изобретение относится к медицине, а именно к методам иммунодиагностики туберкулеза. Цель изобретения — повышение

Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к методам иммунодиагностики туберкулеза.

Цель изобретения — повышение точности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Антиген — гликопептид клеточной оболочки микробактерий БЦЖ фиксируют на полистероловых круглодонных 96-луночных планшетах в количестве 20 мкг/мл или 2 мкг на 100 мкл на лунку в карбонат-бикарбонатном буфере рН 9,6 в течение 16-24 ч при 40С.

По окончании сорбции раствор антигена удаляют сильным встряхиванием, после чего планшет закрывают крышкой, герметично заклеивают лейкопластырем и хранят при 4 С до 6 мес без потери биологической активности.. Ы„„1672ЗЬВА1 точности способа. Пеедварительно из туберкулезного микроба (штамм БЦЖ) выделяют гликопротеид, который используют в качестве антигена. У больного берут кровь, выделяют сыворотку, которую разводят

1:200 и вносят в микроячейки планшета, сенсибилиэированные антигеном, параллельно с разведенной сывороткой здоровых, после чего проводят иммуноферментный анализ и определяют оптическую плотность в обеих пробах и при увеличении ее значения в пробе с сывороткой крови больного по сравнению с пробой с сывороткой здоровых более чем на 0,2 единицы диагностируют туберкулез. Достигается увеличение точности на 4%.

Перед постановкой реакции планшет отмывают три раза фосфатно-солевым буфером 0,1 М рН 7,2, содержащим 005% Я твин-20. 4

Готовят основные разведения исследуемых сывороток больных 1:200 на фосфат-,1 но-солевом буфере 0,1М рН 7.2, g содержащем 0,05% твин-20, Растворы анализируемых сывороток в количестве 100 мкл вносят в трех порциях в лунки планшета.

Обязательно на каждом планшете ставят контрольные сыворотки — положительную и в отрицательную, Планшет выдерживают в термостате при 37,5 С в течение 60 мин, после чего жидкость из лунок удаляют встряхиванием и отмывают как описано.

Во все лунки планшета вносят по 100 мкл пероксидаэного конъюгата в рабочем разведении1:500, которое устанавливают

1672368

10

20

30

50

55 предварительным титрованием конъюгата каждой серии, Планшеты выдерживают при

37 С 1 ч. После аналогичного отмывания вносят по 0,1 мл субстратной смеси. Субстрат доводят до рН ",9-6,0 0,1N NaOH. Субстратную смесь готовят непосредственно перед заполнением лунок путем соединения субстрата и перекиси водорода в соотношении 10:1, Субстрат — 0,08%-ная

5-аминосалициловая кислота — готовят на дистиллированной воде, подогретой до

65 С, После охлаждения до 20 С устанавливают рН 5,9%6,0 с помощью 0,1N NaOH, Затем вносят по 10 мкл в лунку и выдерживают в течение 60 мин в защищенном от солнца месте. Результат реакции учитывают инстоументально на знзиметре — вертикальном спектрофотометре типа "Мультискан" на длине волны 450+3 нм. Вычисляют среднее значение иэ трех параллельных определений для каждой сыворотки, В каждом планшете ставят контрольную положительную и контрольную отрицательную (выделенную из крови донора) сыворотки.

Результат анализа указывает на туберкулез, если экстинция исследуемой сыворотки превышает таковую в отрицательном контроле на 0,2. Чистое время проведения способа занимает" ч.

Для получения гликопептида 1,0 г сухого веса клеточных оболочек Бц K экстрагируют 10 мл 13%-ного, тритона Х-100 на магнитной мешалке, затем центрифугируют при 1500 o6/мин в течение 20-30 мин, Надосадочную жидкость по каплям вливают в

100 мл ацетона и оставляют на 20 ч для формирования осадка, затем ацетон над осадком удаляют и осадок центрифугируют

20 мин при 5000 об/мин. Полученный осадок промывают 2 раза эфиром и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 мин, Осадок сушат в термостате. К сухому осадку добавляют постепенно 3 мл физиологического раствора, оставляют на ночь в холодильнике для лучшего экстрагирования, затем центрифугируют при 9000 об/мин в течение 15 мин, К осадку добавляют 1 мл физиологического раствора, центрифугируют при 9000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочные жидкости первого и второго центрифугирования объединяют и получают фракцию гликопептида.

Пример, Больной К, поступил в диагностическое отделение с подозрением на инфильтративный туберкулез легких или острую пневмонию, Бактериоскопия мокроты не выявила микобактерий туберкулеза. Иммунологическое исследование не дало точного ответа на этиологический фактор заболевания.

У этого больного берут 2,5 мл крови, из которой общепринятым способом получают

1 мл сыворотки и проводят определение антител к гликопептиду клеточной оболочки в

ИФА, Для этого планшет, сенсибилизированный данным антигеном в дозе 2 мкг на лунку и хранившимся при 4 С, был отмыт 3 раза 0,1 М фосфатным буфером рН 7,2. содержащим 0,05%-ный твин-20, Разведения исследуемых сывороток 1:200 на том же буфере в количестве 100 мкл наносят на три параллельные лунки планшета. В таком же разведении поставили контрольные положительную и отрицательную сыворотки в трех параллельных лунках. Планшет выдерживают в термостате при 37,5 С в течение

60 мин. Затем жидкость из лунок удаляют встряхиванием и отмывают как описано.

Затем во все лунки вносят по 100 мкл ферментного пероксидазного конъюгата, иэготовленного в разведении 1:500. Планшеты выдерживают при 37,5 С в течение 1 ч. После аналогичного отмывания вносят по 100 мкл субстратной смеси, приготовленной соединением субстрата и перекиси водорода в соотношении 10:1. При этом субстрат . (0,08%- . ную 5-аминосалициловую кислоту) готовят на дистиллированной воде, подо= гретой до 56 С. После охлаждения до 20 С устанавливают рН до 5,9-6,0 с помощью 01

NaQH, Планшеты выдерживают 60 мин в защищенном от света месте. Результат реакции учитывают инструментально на вертикальном спектрофотометре типа

"Мультискан" при длине волны 450+0,3 нм, вычисляют среднее значение из трех параллельных разведений каждой сыворотки, включая контрольные.

Экстинция исследуемой сыворотки (0,597) превышает таковую в отрицательном контроле (0,085), на 0,512, т,е. разница выше

0,2, что указывает на наличие у данного больного туберкулеза.

С помощью предлагаемого способа выявление больных туберкулезом увеличивается на 4% по сравнению с известным (94% больных выявляются предлагаемым способом и только 90% известным) и на 4% возрастает точность способа (у здоровых доноров только в 1 /, наблюдается ложноположительных проб при использовании предлагаамого способа и 5% — известного).

Формула изобретения

Способ иммунологической диагностики туберкулеза, включающий забор крови, выделение сыворотки, инкубацию ее в ячейках микропланшета, сенсибилиэированных антигеном, с последующим выявлением количества антител с помощью иммуноферментного анализа по оптической плотности, 1672368

Составитель В.Литовченко

Редактор А.Козориз Техред М.Моргентал Корректор М.Кучерявая

Заказ 2837 Тираж 389 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа. в качестве антигена используют гликопротеид клеточной стенки туберкулезной бактерии штамма

БЦЖ, а перед инкубацией сыворотку боль- 5 ного разводят 1:200 и при увеличении оптической плотности в пробе с сывороткой больного по сравнению с пробой сыворотки от здоровых более чем на 0.2 единицы диагностируют туберкулез.