Способ получения вакцины против гепатита а

 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в производстве вакцинных и диагностических препаратов. Целью изобретения является упрощение и ускорение способа, а также повышение безопасности целевого продукта. Способ заключается в том, что для упрощения и ускорения процесса получения безопасности в онкогенном отношении вакцины против гепатита А клеточный штамм НАЗ-15 адаптируют к диплоидной культуре клеток фибробластов человека JI - 68, а затем очищают молекулярно-ситовой хроматографией или ультрацентрифигурированием в градиенте CsCl. Способ позволяет получить полностью безопасный вакцинный препарат высокой степени чистоты и иммуногенности. Изобретение может быть использовано в производстве вакцинных препаратов. 1 табл.

Изобретение относится к области медицинской вирусологии и может быть использовано в производстве вакцинных и диагностических препаратов. Получение вакцин против гепатита А, представляющего вторую по распространению вирусную инфекцию, до сих пор сопряжено с большими трудностями. Только с появлением методов культивирования вируса в клеточных культурах открылась возможность получения вирусной массы в более стандартных условиях. Однако отсутствие общедоступных штаммов, отсутствие у вируса выраженного цитопатического эффекта затрудняют получение аттеньюированных штаммов для живой вакцины, а отсутствие высокопродуктивных штаммов вируса, чувствительных клеточных линий и способов контроля за степенью инактивации на доступных лабораторных животных затрудняет получение инактивированной вакцины. Известен способ адаптации вируса гепатита А на диплоидной культуре клеток фибробластов человека. Изолят ВГА адаптируют в течение первых пассажей к первичной культуре клеток почки эмбриона человека, а затем этот штамм переадаптируют к диплоидной культуре клеток фибробластов человека. При переадаптации ВГА к культуре клеток фибробластов человека на первых пассажах вирус размножается очень медленно. Увеличение скорости роста достигается многократными пассажами. Полученный вирусный антиген предполагают использовать в реакциях с антителами в диагностикумах и после соответствующей очистки и инактивации вируса - в качестве вакцины для человека и животных. Однако известный способ предусматривает проведение не менее 10 пассажей вируса на клетках почки эмбриона человека и переадаптацию к клеткам фибробластов в течение 50-75 пассажей. Кроме этого, штамм вируса и клеточные линии для его адаптации депонированы в институте Эрлиха во Франкфурте-на-Майне. Отечественные коллекции данными штаммами и клеточными линиями не располагают. Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ получения инактивированной вакцины к вирусу гепатита А на перевиваемой линии почек зеленой мартышки 4647. Вирус гепатита А (штамм НАS-15) адаптируют в течение 3-х пассажей к перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки 4647. Вируссодержащую жидкость позднее срока используют в качестве инокулята для массового заражения монослоя тех же клеток в матрасах и роллерных флаконах. Вирус культивируют при 37^оС в течение 20 дней с ежедневной сменой среды. Вируссодержащую надклеточную жидкость, полученную при сменах среды, замораживают. Суспензию клеток по окончании инкубаций обрабатывают ультразвуком и ВГА дважды экстрагируют хлороформом. Водные фазы объединяют с вируссодержащей надклеточной жидкостью и концентрируют в 100 раз в системе тангенциального потока. Клеточную ДНК вирусного концентрата удаляют обработкой ДНКазой II. Очистку проводят на колонках с ДЕАЕ-серофазой 6В, макропористым стеклом и биогелем Р-2. Вируссодержащие фракции объединяют, вирус инактивируют формалином (1: 4000) и сорбируют на гидроокиси алюминия. Недостатком данного способа является использование при культивировании вируса гепатита А перевиваемой культуры клеток почек зеленой мартышки 4647, потенциально опасной в онкогенном отношении для человека, требующей введения стадий удаления и очистки вакцинных препаратов от примесей клеточной ДНК до уровня 1-10 пг на дозу. Для удаления ДНК в прототипе используют фермент дезоксирибонуклеазу. Препараты ДНКазы отечественного производства содержат примеси протеаз и неспецифических нуклеаз, а очищенные препараты зарубежного производства малодоступны и догоростоящи. Кроме того, обработка ДНКазой не дает 100% гарантии разрушения клеточной ДНК, необходимы контроль активности, специфичности и чистоты ДНКазы и количества остаточной клеточной ДНК в препаратах. Последний осуществляют методом гибридизации - сложным, трудоемким, дорогостоящим и требующим аттестованных помещений для работы с радиоактивными изотопами. Цель изобретения - упрощение, ускорение способа, а также повышение безопасности целевого продукта. Указанная цель достигается тем, что ВГА (штамм НАS-15) переадаптируют к диплоидной культуре клеток легкого человека Л-68, безопасной в онкогенном плане для человека при производстве вакцины. Сущность способа заключается в том, что проводят 11 "слепых" пассажей вируса на культуре клеток Л-68, выращенной на среде Игла МЕМ с добавлением 5% -ной сыворотки эмбрионов плодов коровы. С 13-го по 19-ый пассаж вирус культивируют методом персистирующей инфекции на тех же клетках. После повышения продукции вируса переходят к роллерному культивированию. К 24 пассажу уровень продукции (при 3-недельном культивировании) достигает уровня, достаточного для очистки и получения вакцинных препаратов. Полученный на клетках Л-68 вирус очищают высокоскоростным центрифугированием или на колонке с макропористым стеклом, инактивируют формалином (1: 4000) и адсорбируют на гидроокиси алюминия. Иммуногенность полученного препарата ВГА проверяют на морских свинках (см. табл. ). Новым и существенным отличием в предполагаемом изобретении по сравнению с прототипом является адаптация штамма НАS-15 к диплоидной культуре клеток легкого человека Л-68, безопасной в онкогенном отношении, что позволяет исключить стадии удаления и очистки целевого продукта от примесей клеточной ДНК, требующие использования высокоочищенных препаратов ДНКазы и хроматографических сорбентов (сефароза 6В и биогель Р-2) зарубежного производства и, тем самым, ускорить и упростить технологический процесс производства и контроля вакцины. Примеры конкретного выполнения способа приведены ниже. П р и м е р 1. Получение инактивированной вакцины против гепатита А. Хорошо сформированный монослой клеток диплоидной культуры клеток эмбриона легкого человека Л-68 (ИВП-1 8/9/175 коллекция Института медицинской генетики АМП СССР) заражают штаммом НАS-15 вируса гепатита А. Множественность заражения составляет одну десятую тканевой единицы вируса (ТКИД₅₀) на клетку. После адсорбции вируса при 37^оС в течение 2 ч добавляют среду Игла с удвоенным содержанием аминокислот и витаминов (Игла-2 МЕМ), содержащую 5% -ную сыворотку эмбрионов коров и антибиотики. Инкубацию осуществляют при 37^оС с ежедневной сменой среды в течение 21 дня. По окончании инкубации надклеточную жидкость удаляют. Клетки разрушают в 5 мл фосфатно-солевого буфера, рН 7,4 (ФСБ), трехкратным замораживанием (-70^оС) - оттаиванием (+20^оС). В полученном клеточном лизате иммуноферментным методом анализируют содержание вирусного антигена. Этим клеточным лизатом заражают монослой клеток последующих 11 пассажей. Начиная с 13 пассажа клетки Л-68 промывают версеном до полного отслоения, добавляют среду Игла МЕМ с 5% сыворотки, интенсивно встряхивают и рассеивают 1: 2. Культивирование осуществляют при 37^оС, рассев осуществляют после формирования плотного монослоя. Так ВГА культивируют на клетках Л-68 до 19 пассажа, когда продукция вируса достигает 1: 16 - 1: 32. Начиная с 20 пассажа вирус выращивают на клетках линии Л-68 в роллерных бутылях (850 см²). Хорошо сформированный монослой клеток Л-68 заражают клеточным лизатом, содержащим ВГА (штамм HAS-15) при множественности заражения, равной 10^-1 - 10^-2 ТКИД₅₀ на клетку. Вирус адсорбируют 2 ч при 37^оС и культивируют 21 день с еженедельной сменой среды Игла-2 МЕМ, содержащей 5% сыворотки плодов коровы. По окончании инкубации надклеточную жидкость удаляют. Клетки промывают версеном и снимают 0,1М натрийфосфатным буфером рН 7,4. Полученную суспензию клеток разрушают 3-х кратным замораживанием-оттаиванием. Клеточный дебрис удаляют низкоскоростным центрифугированием. К вирусной суспензии добавляют равный объем хлороформа, тщательно перемешивают 20 мин на холоду, затем центрифугируют (1000 об/мин, 20 мин, при 4^оС) верхнюю фазу, содержащую вирусный антиген, отбирают и очищают на хроматографической колонке с макропористым стеклом. Элюцию проводят 0,02М натрийфосфатным буфером, рН 7,4. Во фракциях определяют содержание белка и вирусного антигена. Антигенсодержащие фракции объединяют, подвергают стерилизующей фильтрации и инактивированию формалином (конечное разведение 1: 4000), добавляют гидроокись алюминия до концентрации 1,5 мг/мл. Выход вируса 30-40% , концентрация белка в препарате 30 мкг/мл, содержание антигена 1: 8-1: 16. П р и м е р 2. Очистка и концентрирование вируса. Вирус ВГА выращивают, выделяют, разрушают, стерилизуют, анактивируют и сорбируют аналогично примеру 1. Кроме того, очистку и концентрирование вируса проводят в градиенте хлористого цезия (25-50% ), ротор SW-55, 15000g, 50 ч, 4^оС. Градиент фракционируют по 0,5 мл. Вируссодержащие фракции объединяют и доочистку проводят повторным центрифугированием на роторе WS-28 при 100000 g, 8 ч, 4^оС. Осадок растворяют в 0,1М натрийфосфатном буфере, рН 7,4. Выход 30-60% , концентрация белка 200 мкг/мл, содержание антигена 1: 100-1: 1000. П р и м е р 3. Проверка иммуногенной активности вакцины. Иммуногенную активность препарата испытывают на морских свинках (по 10 морских свинок самцов массой 200-250 г на серию) путем трехкратного введения препарата внутримышечно по одной дозе (0,02 мкг/мл) с интервалами в 14 дней. Титр анти-ВГА проверяют в сыворотке крови, взятой через две недели после последней иммунизации. Как видно из приведенных в таблице данных, полученные вакцинные препараты обладают высокой иммуногенной активностью. Вакцина нетоксична для морских свинок, не вызывает изменений кожных покровов в местах введения и гибели животных. Данные по характеристике препарата вакцины против гепатита А представлены в таблице. Титр сыворотки определен в реакции конкурентного иммуноферментного анализа. Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет упростить и ускорить технологический процесс получения целевого продукта за счет исключения стадий удаления и хроматографической очистки от примеси клеточной ДНК и создать вакцину против гепатита А, полностью безопасную в онкогенном отношении для человека. (56) Патент США N 4506016, кл. С 12 7/08, 1985. Авторское свидетельство СССР N 1389095, кл. А 61 К 39/29, 1986.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГЕПАТИТА А, включающий размножение вируса штамма HAS-15 в культуре клеток с последующим разрушением клеток, очисткой антигена, концентрированием, инактивацией и сорбцией на носителе, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, а также повышения безопасности целевого продукта, размножение вируса проводят в диплоидной культуре фибробластов человека Л-68.

РИСУНКИ

Рисунок 1

MM4A - Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 25.08.2007

Извещение опубликовано: 10.03.2009        БИ: 07/2009

---