Способ оценки осмотической резистентности лейкоцитов

 

Изобретение относится к медицине, точнее к иммунологии и гематологии, и предназначено для оценки функциональной активности лейкоцитов. Целью является повышение точности оценки осмотической резистентности лейкоцитов. Для этого выделяют на двойном градиенте плотности фиколлаверографина чистую популяцию лейкоцитов, которую инкубируют с гипотоническим 0,4-0,5%-ным раствором хлорида натрия, затем с помощью гемоцитометра регистрируют количество уцелевших клеток (через 14, 30,45 мин, например). По изменению полученных показателей в сравнении с аналогичными показателями у доноров (норма) судят о снижении или повышении осмотической резистентное™ лейкоцитов. Предлагаемый способ позволяет повысить объективность результатов за счет замены визуальной микроскопической оценки на объективную оценку с помощью гемоцитометра .

СОЮЗ С08ЕТСКИХ

СОЦИЛЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (зо 5 6 01 М 33/".3

ГОСУДАРСТВЕН<ЫИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

"."Ж334р

t(:- ",Рл -, ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ "

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4651479/14 (22) 15.02.89 (46) 07.09.91. Бюл, М 33 (71) Челябинский государственный медицинский институт (72) С.Н.Теплова, В.А,Чернов, Е.А.Чухарева и А.Ю.Пищальников (53) 615.375(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

% 909635, кл, G 01 N 33/96, 1982, (54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ОСМОТИЧЕСКОЙ

РЕЗИСТЕНТНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ (57) Изобретение относится к медицине, точнее к иммунологии и гематологии, и предназначено для оценки функциональной активности лейкоцитов. Целью является повышение точности оценки осмотической реИзобретение относится к медицине, точнее к иммунологии и гематологии, и предназначено для оценки функциональной активности лейкоцитов, Цельиэобретен м-псвышение1жссти способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Выделяют на двойном градиенте плотности чистую популяцию лейкоцитов: берут плазму, обогащенную лейкоцитами в концентрации 10 клеток в 1 мл, из отстоявшейся в течение 45-60 мин при 37 С веноэной гепариниэированной крови, смешанной с половиной объема бф (вес — объем) декстрана 75, супернатант наслаивают на двойной градиент фиколлверографина (1,093-1,078) и центрифугируют в течение 30 мин при 40С, 1500 об/мин. Затем нижний слой клеток,,, Ы,„1675768 А1

I зистентности лейкоцитов. Для этого выделяют на двойном градиенте плотности фиколлаверографина чистую популяцию лейкоцитов, которую инкубируют с гипотоническим 0,4 —.0,5ь-ным раствором хлорида натрия, затем с помощью гемоцитометра регистрируют количество уцелевших клеток (через 14, 30, 45 мин, например). По изменению полученных показателей в сравнении с аналогичными показателями у доноров (норма) судят о снижении или повышении осмотической резистентности лейкоцитов.

Предлагаемый способ позволяет повысить объективность результатов эа счет замены визуальной м,»:кроскопической оценки на объективную оценку с помощью гемоцитометра. состоящий на 75 — 80ь из нейтрофилов, собирают и дважды отмывают в среде 199 (1500 об/мин, 4 С, 3 мин), ресуспендируют в конечной концентрации (1 х 10 ) кл/мл, клетки со средой 199 в количестве 32 мкл помещают B 10 мл физиологического раствора и 10 мл 0,4-0,5%-ного раствора натрия хлорида.

Оценку осмотической реэистентности лейкоцитов проводят с помощью кондуктометрии, на гемоцитометре. Измерения осуществляютт на гемоцитометре через 1,15,30, 45 мин в опыте (в гипотоническом растворе) и сразу — в контроле (в физиологическом растворе), регистрируют количество осмотически устойчивых клеток ($). По изменениям осмотической реэистентности исследуемого образца относительно контроля и в срав" 6757i.8 нении с показателями асматической резистентнасти у доноров (норма) судят о снижении Осматическах ppзис i нтности или повышении ее, Учет осуществляки с помощь гемоциTàìåòðà Лаборскель-Анализат О (фирма

M еди кар).

Условия измерения; диаметр капилляр;

100 мкм, ток, применяемый для измерения

100 мкА, пороги дискрими ации для физио. логического раствора 2,5 — 7,5 8, для "ипатонического 4,3-5,, Б (для доноров). Выбор напряжения дискриминации для под:чет-." асмотически устойчивых к еток зависит От результатов предварительной регистраци . по монитор / импульсаВ, саставля ащих ба лее 60;4 от длины ординаты.

Кроме ОпреДеления собственно Осмати" ческой реаистентности, предлагаемый способ позволяет регистрировать кривую распределения клеток в зависимости ат диаметра, максимальный диаметр и абьем, до которого увеличиваатс клетки перед разрушением (а также количества соответствующих клеток): па монитору на оси абсцисс регистрируют номер канала, в пике кривой распределения, стносящегося к наибольшему количеству клеток даннага диаметра, в "ипотаническам растворе максимальный диаметр, да которо"G увеличиваются клетки, реглстрируют через 1 мин после помещения клеток в гипотанический раствор. Режим измерения — режим дифференциальной дискриминации. Регистрация максимальнага диаметра, да кат,,рого увел ичива ются клетки пе.: ед разрушением, дает вазмогкность оценить степень эластичности мембранц клеток, которая, наряду с асматической резлстентностью, имеет большое значение в диагностике мембранных нарушенлй.

Расчет диаметра клеток производят па формуле ., 0 = О 666825 / -- — — — "

K Cl !/3

Ц J где К вЂ” коэффициенI измерительной рубки (8,619 10 3);

Сл — номер канала;

-4

U — величина измеряемого тока (1-10 А).

Расчет G6bPMB I(lBl GK г ровадят !lc формуле .

К -и

Ч = О 15625 у 1

I." B где а — коэффициент формы частиц 1,1 — для гранулоцитов примерна равен 1,=-.

Определяли каэффицлент набухания клеток по формуле:

I0

ОП

2 ,I0

И

4а

1

П =.— :007(, В гдв А — средний диаметр клеток В изотоническом растворе;

 — средний диаметр клеток в гипотони -IIGi кОм растВоре.

Значение коэффициента набухания меньше 84,553 ) а свидетельствуют о повышении эластич;- асти мембраны, значение

;;: iG показателя, превышающее 89,2477ь, свидетельствуют а снижении ее.

Средний Диаметр KlleTGK В физиологическом растворе (контроль) составляет

12,5+0,599 м км; с Оедн ий объем

1022,1351 +. 146,0206 мкм .

СреДний Диаметр, Да кОтОООГО клет ки набухают в гипатаническом растворе

14,384.+0,3 мкм; средний Объем

1557,5392+. 9.,3462 мкм, Пример 1. Донор А, Проводили исследование Осматическай резистентности лейкоцитов (гранулоцитов) в соответствии с предлагаемым способом. Брали плазму, обогащенную лейкоцитами в концентрации

10В кл/мл из GTcTаявшейся в течении 45 мин прл температуре 37 С венозной гепаринизираВаннам KpoBN, смешанной с пОлОВЙнай Объе ;а 6;ь (вес/объем) декстрана 75, супернатант наслдиВал«HB двойной Градиент ф«каллверографина (1,093-1,078) и центр«фуг«равали в течение ЗО мин при 4 С и 1500 аб/м«н. Нижний слой кле-ак, содержащий Гранулациты, саб«рал«и ДважДы От мывали В среде 199 (1500 аб/мин, 4 С, 3 мин), ресуспанд«равали в конечной концентрации 10 клеток в мл, Клетки са средой

199 в количестве 3? мкл помещали В 10 мл физиолаплческага раствора и в 10 мл 0,45 /-ного раствора натрия хларида. Измерение проВодил«на гемацитаметре ЛабарскельАнализатар сразу, через 1, 15, 30, 45 мин.

Диаметр капилляра 100 мкм пр«силе тока 100 мкд. Пîpîã;.,«скриминBции для физиологического раствора 2,5 — 7,5 В, для гипатан«ческага 4,3-.5,1 B. Получили соответственна через " ."З."д, 45 мин значения асмотическай резистентнасти лейкоцитов (гранулацитав, 78 21а . 58 74/;

4r, 13ag

Попу" енные показ:nели свидетельству.От о нормальной осматическай резистент- ости лейкоцитов докора А.

Одновременно с регистрацией количества клеток регистрировали номер канала(в гайке криьай pBciipeäBëения); Отнасяы ийся к наибольшему количеству клеток данного диаметра, По формулам

13 .= Π666825 / (— - — )

K" C„

) 1675768

Составитель Ь. Мануйлов

Редактор М. Бланар Техред М.Моргентал Корректор О. Кундрик

Заказ 2998 Тираж 388 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 и

Ч-0,15625. К С"

Ц а производили расчет среднего диаметра клеток и объема в физиологическом и гипотоническом растворах. По формуле 5

n = — 100

«А

В определили коэффициент набухания.

Средний диаметр клеток, до которого они увеличивались в гипотоническом рас- 10 творе составил 14,5395 мкм, средний объем

1606,2123 мкм; в физиологическом раствоз. ре средний диаметр 12,6955, объем

1022,1351 мкмз. Коэффициент набухания

86,014 f,. 15

Полученные данные свидетельствуют о нормальных размерах и эластичности мембрань. лейкоцитов у данного донора.

Пример 2, Проводили определение одного и того же образца крови донора с 20 различными исследованиями в соответствии с предлагаемым и известным способами.

Из представленных результатов видно, что колебания данных в предлагаемом спо- 25 собе намного меньше, чем в известном, что также свидетельствует о высокой точности и объективности предлагаемого способа.

Проведенные испытания предлагаемого способа подтвердили его преимущества 30 перед известными способами оценки осмотической резистентности лейкоцитов, заключающиеся в повышении объективности результатов, точности — за счет замены визуально микроског ческой оценки на обьективную гемоцитометрию.. Кроме оценки осмотичесой резистентности лейкоцитов, способ позволяет определять и степень набухания уцелевших клеток, регистрировать максимальный диаметр клеток, до которого они набухают перед разрушением, т.е. позволяют получить более полную информацию о функциональной активности лейкоцитов. Замена трудоемкой, утомительной визуальной микроскопии не только повышает объективность и, следовательно, точность получаемых результатов, но значительно улучшает условия работы исследователя, t Формула изобретения

Способ оценки осмотической резистентности лейкоцитов путем инкубации с раствором хлорида натрия клеток периферической крови с последующим учетом реакции, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, из периферической крови выделяют чистую популяцию лейкоцитов на двойном градиенте плотности и инкубируют с 0,4-0,5 -ным раствором натрия хлорида, а учет реакции ведут по количеству неразрушенных клеток с помощью гемг.цитометра.