Способ определения ассоциированного с беременностью протеина-а

 

Изобретение относится к медицине, биологии , а именно к определению ассоциированного с беременностью белка протеина-/6 в различных биологических жидкостях и экстрактах ткани. Цель изобретения - повышекие чувствительности и сокращение времени анализа. 8 каждую лунку полистиролового планшета вносят по 0,2 мл раствора гепарина (15 мкг/мл), инкубируют в течение 1,5 ч при 37°С, отмывают. Затем вносят разведение исследуемого материала , инкубируют, отмывают. В дальнейшем инкубируют со специфическими антителами с последующим определением концентрации белка путем соотношения оптической плотности s опытной пробе с калибровочными В сравнении с прототипом увеличивается чувствительность способа в 20 раз, а длительность анализа сокращается в 10 раз.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (и) s 601 и 33/515

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

K АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4675094/14

22) 06.04,89

46) 07.09.91. Бюл, М 33 (71) Новокузнецкими институт усовершенствования врачей (72) С.Г.Жабин и Н;А.Зорин, (53) 615.375(088.8) (56) Berslnger N,А. СИп. СЬев. Acta, 1983, 134, р.297-306. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АССОЦИИРОВАННОГО С БЕРЕМЕННОСТЬЮ ПРОТЕИНА-А (57) Изобретение относится к медицине, биологии. а именно к определению ассоциированного с беременностью белка протеина-А в различных биологических жидкостях и эксИзобретение относится к медицине, биологии, а именно к биохимии и иммунологии, и может быть использовано в акушерстве, гинекологии, онкологии при

on ределени и кон центра ци и ассоциированного с беременностью протеина-А в раз личных биологических жидкостях и экстрактах тканей.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа, а также сокращение времени анализа, Способ осуществля ют следующим образом.

В каждую лунку полистиролового план шета вносят 0,2 мл раствора (15 мкг/мл) гепарина в забуференном фосфатами физиологическом растворе с рН 7,0 и инкубируют в течение 1,5 ч при 37 С. После сенсибилизации лунок и в дальнейшем планшеты промывают эабуференным фосфатами

„„Я „„1675773 А1

t трактах ткани. Цель изобретения — повышение чувствительности и сокращение времени анализа, В каждую лунку полистиролового планшета вносят по 0,2 мл раствора гепарина (15 мкг/мл), инкубируют в течение 1,5 ч при 37 С, отмывают. Затем вносят разведение исследуемого материала, инкубируют, отмывают, В дальнейшем инкубируют со специфическими антителами с последующим определением концентрации белка путем соотношения оптической плотности в опытной пробе с калибровочными. В сравнении с прототипом увеличивается чувствительность способа в 20 раз, а длительность анализа сокращается в 10 раз,, физиологическим раствором с рН 7,4, содержащим 0,17;-ный твин-20, не менее трех раз. Для предупреждения неспецифического связывания в лунки вносят по 0,2 мл 1 -ного раствора бычьего сывороточ- 3 ного альбумина в забуференном фосфата- Ql ми физиологическом растворе (рН 7,4) и инкубируют 30 мин при 37 С. Затем лунки 4 промывают., Од

Калибровочные разведения стандартной смеси сывороток крови беременных женщин с известной концентрацией ассоциированного с беременностью протеина-А вносят в лунки двух рядов с дублированием каждого разведения. Исследуемые образцы биологических жидкостей или экстрактов тканей помещают в остальные лунки планшета, Обьем антигенсодержащих растворов составляет 0,2 мл. Инкубацию проводят в течение 1 ч при 370С. После инкубации и

1i>75773 отмывки fl l3HlljeTB в Jl/IIKH FIHGCRT rlo 0,2 IMMI раствора кроличьих моноспецифических аффинна очищенных антител поатив ассоциированного с беременностью протеина-А в забуферном фосфатами физиологическом растворе(рН 7,4) в концентрации 40 мкг/мл и инкубирут планшег g течени е 2 «при <7 1 затем. планшет отмывают.

В лунки вносят по 0,2 мл козьих антител против иммуноглабулинов кролика, канъюгированных с пероксидазай из хрена, в рабочем разведении l,1000 в забуференнам фосфвтами физиолагическс м растворе, рН

7,4, и выдерживак>г в ечение 1,5 ч при

,:37 С, после чего пг„аншет промывают, За1 тем в лунки вносят 0,15: .л субстратнагo оаствора рН 5,0(0,05 Ч лимонной кислоты, G,1 М двухзамещеннага фасфата натрия, 0.,047ь-ного ортофениг ендиамина и

0,0127-най перекиси водороде), Ферментативное окисление субстрата при участии иммобилизаваннай пероксидазы из хрена проводят в течение 30 мин при 20 С с защищенном от света месте. Реакцию останавливают добавлением 0,05 мл 2 M серной кислоты. Относитель l To оптическую плотность содержимого ка>кдай лун ки определяютт спектрофотаметрически при длине волны 492 нм по атнашени а к контрольным лункам, в которые вместо антигенсадержащих растворов вносят эабуференный фасфатами физиологический раствор (рН 7,4).

Пример 1. Проводили определени концентрации ассоциированного с беременностью протеина-А в сыворотке:<рави небеременной женщины iÄ 28 ле, донора со станции переливания крови. Предварительно В лунки планшета Вносят 0,2 мл pac" твора (15 мкг/мл) гепарина в забуфернам фосфатами физиологическом растворе (хлористый на.грий 8 r, одназамещенный фасфат калия 0,2, двузамещенный фасфат натрия

2,9, хлористый натрий 0,2 дистиллирован. ная вода до 1000 мл) с рН 7,0 и инкубируюего 1,5 ч при 37"С. Для промывки лунок используют забуференнь1й фосфатами физиологический раствор с ph 7,4, садер>кащий 0,1 -ный твин-20, причем промывку производили на этом этапе и в дальнейшем троекратно.

Для предупре>кдения неспецифи«ескаГО СВЯзыВаниЯ В лунки вно Ят 0,2 мл 1 -ного раствора бычье о сыворотачного альбумина в забуференном фосфатами физиологическом растворе (рН 7,4) и инкубировали 30 мин при 37 C. Затем лунки промывают. Для AOGTpoeH AR калибравачнсго графика В 9 лунок двух рядов вносят разведения стандартной смеси сывороток крови беременных женьцин (ill триме Тр беременнасти) с исходной концентрацией ассоциированного с беременностью протеина-А 80 мкг/мл, измеренной с помоЩью методов кол ичествен ного иммуноэлектро5 фаоеэа, Разведения смеси сывороток в забуференнам фосфатвми физиологическом растворе (рН 7,4) были следующими, нг/мл:

2000; i 0OO; 200; 100; 20; 10; 2; 1; 0,5, В лунки

10 их вносят в объеме 0,2 мл. В две лунки этого же планшета вносят па 0,2 мл сыворотки донора гл„а еще в две лунки вносят по 0,2 мл забуференного фасфатами физиологического раствора (рН 7,4) и используют по15 сгедние в качестве контроля, Инкубацию антигенсодержащих и контрольных растворов проводят в течение l ч при 37 С.

После инкубации и отмывки в рабочие лунки вносят па 0,2 мл раствора кроличьих

20 маноспецифи«еских афинна очищенных ан-. тител против ассоциированного с беременностью протеина-А в забуферен нам фосфатами физиологическом растворе (рН

7,4) в концентрации 40 мкгlмл и оставляют

25 планшет на 2 ч при 37 С, проводят отмывку планшета. Затем в рабочие лунки вносят по

G,2 мл ка":ü õ антител против иммуноглабулинав кролика, конъюгираванных с пероксидаэай из хрена в разведении 1:1000 в

30 эабуференнам фасфатами физиологическом раствора (рН 7,4) и выдерживают 1,5 ч при 37ОС, после чего планшет промывают.

Затем в рабочие лунки вносят по 0,15 мл субстратнога раствора, рН 5,0 (0,05 M ли 35 монной кислоты, 0,1 М,двухзамещенного фасфата натрия, 0,04 -нага артафенилендиамина и 0,012%-най перекиси водорода).

Зту стадию ферментативнога окисления субстрата при участии иммабилизованной

40 перрксидаэы иэ хрена проводят в течение

ЗО мин при 20ОС в защищенном от света месте.

Оптическую платность содержимого каждой лунки, в которую внасиг и калибро45 вочные разведения стандартной смеси сывороток и сыворотка крови исследуемого донора, определяют г,:ри длине волны 492 нм по отношению к контрольным лункам, в которые вносился забуференный фосфата50 ми физиологический раствор (pH 7,4). Получены следующие значения относительной оптической плотности (в единицах оптической плотности) для калибровочных разведений: 2000 нг/мл — 0,728, 0,722; 1000 нг/мл—

55 0,677, 0,674; 200 нг/мл — 0,530, 0,533; 100 нг/мл — 0,479, 0,480; 20 нг/мл — 0,382, 0,383;

10 нг/мл — 0,338, 0,338; 2 нг/мл — 0,216, 0,215; 1 нг/мл — 0,174, 0,174; 0,5 мг/мл—

0,050, 0,05! . Ha основании этих данных был построен калибровочный график, отражаю1675773 дальнейшие этапы анализа и их продолжительность соответствовали примеру 1, Получены следующие значение относительной оптической плстнс:.ти (в единицах оптичеcûé плотности) для калибровочных разведений: 2000 нг!мл — 0,718, 0,724; 1000 нг/мл—

0 680, 0,670; 200 нг/мл — 0,541, 0,538; 100

-;-.гlмл — 0,482, 0,481; 20 нг/мл — 0,378, 0,380;

"0 иг/мл — 0,342, 0,342; 2 нгlмл — 0,210, 0,212; 1 нг/мл — 0,179, 0,176; 0,5 нг/мл—

Я.,048, 0,050, На основании этих данных был

10 псс-:рсен калибровочный график. Относите ьная плотность содержимого лунок, в которые вносился экстракт яичниковсй ткани, равнялась 0,244 и 0,250. что соответствует на калибровочном графике концентрациям эйсциированнсго с беременностью протеииа-А 3,9 и 4,0 нг/мл. После усреднения результатов двух параллельных исследоваэкстракте яичника ткани, взятой у больной

М„равняется 3,95 нг/мл. !

4спольэсвэние изобретения существенно расширяет возможности применения иммунсферментнсго метода в широкой клинической и научно-исследовательской практике. Достигнуто значительное (в 20 раз) повышение чувствительности иммуноферментнсго способа определения концентрации асссциирсвгннсго с беременностью протеина-А в различных биологических ж;1дксстях и экстрактах тканей. По иэвест30 ному способу чувствительность составляет

10 н гlмл, о- по предлагаемому 0,5 нгlмл. Это сочетается с десятикратным сокращением

35. времени проведения анализа (по известном«ллительность анализа составляет 72 ч, а

nî предлагаемому способу 7 ч).

Формула изобретения . Способ определения ассоциированного

40 с беременностью протеина-А путем иммуноферментиого анализа с использованием сенсибилиэированной твердой подложки и определением концентрации протеина-А по величине оптической плотности, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа и сокращения времени анализа, твердую подложку сенсибилизируют. гепарином.

Составитель B. Литовченко

Редактор М. Бланар Техред М.Моргентал Корректор О. Куидрик

Заказ 2998 Тираж 38б Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 щий зависимость между относительной оптической плотностью содержимого лунок и соответствующей концентрацией в них ассоциированного с беременностью протеина-А, Относительная оптическая плотность содержимого лунок, в которые вносилась сыворотка крови женщины — донора, составила 0,404; 0,409, что соответствует на калибровочном графике концентрации ассоциированного с беременностью протеина-А 38,0 и 38,2 иг/мл, среднее значение результатов анализа 38,1 нг/мл. Продолжительность всего анаг изэ равнялась 7 ч, Пример 2. Поовсдят измерение концентрации ассоциированного с беременностью протеина-А в моче беременной Н„28 лет, 30 недель беременности. Предварительно мочу центрифугируют и фильтруют.

Bceдальнейшие этапы анализа и их продал. жительность аналогичны примеру 1. Получены следующие значения относительной оптической плотности для калибровочных разведений: 2000 иг/мл — 0,719, 0,728; 1000 нгlмл — 0,675, 0,679;, 200 нг/мл — 0,529, 0,531; 100 нг/мл — 0,490, 0,490; 20 нг/мл—

0,384, 0,379; 10 нг/мл — 0,342, 0,346; 2 нг/мл — 0,210, 0,211; 1 нг/мл — 0,170, 0,170; 0,5 нг/мл — 0,048, 0,049. На основании этих данных был построен калибровочный график. Относительная оптическая плотность содержимого лунок, в которые вносилась моча беременной Н.. î ".,çàëàñü 0,355 и

0,356, что соответствует концентрации ассоциированного с беременностью протеина-А 15,6 иг/мл.

Пример " . Проводили определение

° концентрации ассоциированного с беременностью протеина-А в экстракте яичниковой ткани, взятой у больной M., 31 г., оперированной по поводу поликистоза яичников. Предварительно кусочек яичниковой ткани массой 0,5 г гомогенизировали в присутствии 1,5 мл забуфереиного фосфатами физиологического раствора (рН 7,4), содержащего соевый ингибитор трипсина в концентрации 10 мкг/мл, затем гомогеита поместили на 18 ч в холодильную камеру при 4 С, после этого его отцентрифугировали, а супериатант профильтровали для полного отделения от фрагментов ткани. Все

20 ний находим, что концентрация ассоциированнс,о с беременностью протеина-А в