Способ определения ингибиторов трипсина в сыворотке крови

Авторы патента:

G01N33/68 - с использованием протеинов, пептидов или аминокислот

Способ определения ингибиторов трипсина в сыворотке кроаи относится к медицине , а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть исполь зовано для диагностики острых и хронических воспалительных процессов, обусловленных недостаточностью ингибиторов трипсина в сыворотке крови. Цель - повышение точности . Цель достигается тем, что к 0,5 мл сыворотки крови прибавляют 6,5 мл трипсина

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

<э.> s 6 01 N 33/E8

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4682840/ 1 4 (22) 24.04.89 (46) 07.09.91. Бюл. М 33 (71) Львовский государственный медицинский институт (72) M.Â.Êèíàx, Е;А,Захария, Я,Н.Романишин и Б.В.Западнюк (53) 612.015(088,8) (56) Веремеенко К.H., Голобородько. О.П., Кизим А.И. Протеолиз в норме и при патологии. вЂ” Киев, Здоровья: 1988, с,":74 вЂ” 175. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНГИБИТОРОВ ТРИПСИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ (57) Способ определения ингибиторов трипсина в сыворотке крови относится к медици не, а именно к клинической лабораторной

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики острых и хронических воспалительных процессов, обусловленных недо.статочностью ингибиторов трипсина в сыворотке крови, Цель изобретения вЂ” повышение точно-. сти способа.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве субстрата трипсина используют белок азофибрин, продукты расщепления которого образуют в щелочной среде раствор красного цвета, по интенсивности соответствующий протеолитической активности трипсина, затем добавляют исследуемую сыворотку и по разнице (интенсивности окрашивания) устанавливают уровень ингибиторов трипсина.,, ЯЛ2„„1675776 А1 диагностике, и может быть использовано для диагностики острых и хронических воспа":èòåëhèûõ процессов, обусловленных недостаточностью ингибиторов трипсина в сыворотке крови. Цель вЂ” повышение точности. Цель достигается тем, что к 0,5 мл сыворотки крови прибавляют 0,5 мл трипсина (25 мкм), спустя 15 мин вЂ” 5 мг сухого аэофибрина, инкубируют 1 ч при 37 С, центрифугируют, затем к, 3 мл супернатанта прибавляют 0,05 мл 10 н. гидроксида натрия и колориметрируют при 500 мл. Расчет активности ингибиторов трипсина производят по калибровочному графику. Предложенный способ позволяет повысить точность в 1.6 раза по сравнению с прототипом. 3 табл.

Способ осуществляют следующим образом.

° В . о

Используют следующие материалы и реактивы: плазму или сыворотку крови, раз- (Л бавленную в 50 раз трис-буфером; азофибрин; трис-буфер (рН-8,1, 0,05 М): в мерной колбе на 1000 мл растворяют 1,225 г тригид- g роксиметиламинометана, в 500 мл дистиллированной воды, прибавляют 7,5 мл

10 g -íîão раствора CaClz и доводят дистил- . лированной водой до метки, рН 8,1 доводят

1 н. раствором НО; 1 н. раствор HCI готовят из фиксанала; раствор кристаллического трипсина: S мг препарата растворяют в 5 мл трис-буфера (матричный раствор), стабилен при +4ОС в течение 5-6 дней, перед исследованием готовят рабочий раствор разбавлением матричного трис-буфера в 20 раз i675776

Таблица 1

Рабочий раствор Трис-буфер, мл ипсина(50 мкг/мл1 i

Концентрац сина, мкг i

1,0

0,2

0 K !

2,5

5,0

1,0

10, Таблица 2

Количе следс (+ мкмо

88,1 =

64,,6 + (1 мл содержит 50 м :г трипсина); 10 н, раствор гидроксида натрия.

К 0,5 мл разведенной сыворотки прибавляют 0,5 мл рабочего раствора тригсина (25 мкг), Для образования комплекса трип- 5 син-ингибитор смесь выдерживают в течение 15 мин при комнатной температуре.

Добавляют в пробирку 5 мг сухого азофибрина, смешивают и ставят в термостат на 1 ч при 37 С, Вынимают из термостата, добав-,О ляют 3 мл дистиллированной воды, размешивают и центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин. Отбирают 3 мл надосадочной жидкости и переносят в другую пробирку, прибавляют 0,05 мл 10 н.гидроксида натрия, 15 колориметрируют на ФЭКе при длине BGA v 500 нм в кювете 5 мм против воды.

Пример. Из каждой пробирки отбирак т по 0,5 мл раствора трипсина, прибавляют по 0,5 мл изотонического раствора 20 хлорида натрия и по 5 мг азофибрина, перемешивают, ставят в термостат при 37 С на

1 ч, затем прибавляют 3 мл дистиллированной воды, перемешивают, центрифугируют

15 мин при 3000 сб/мин. Отбирают. 3 мл 25 надосадочной жидкости, прибавляют 0,05 мл 10 н.раствора гидроксида натрия и колориметрируют на ФЗКе гри длине волны

500 нм против дистиллированной воды в кювете 5 мм. 3Q

Оптическая плотность пробы, к которой трипсин реагировал в присутствии сыворотки крови, 0,16. По калибровочному графику находят, что это соответствует 5,48 мк, трипсина. Таким образом, концентрация 35 трипсина, связанная с ингибитором, составляет 25 мкг - 5,48 мкг =-: 19,52 мкг, Расче. активности ингибиторов трипсина в исследуемой сыворотке производят по калибровочному графику.

Калибровочный раствор трипсина приведен в табл, l.

Содержание ингибиторов рассчитывают по формуле:

19.5 50 1000

0 5 24000 вЂ” 81,33 мкмоль/л, где 19,52 вЂ” количество связанного трипсина (1 моль трипсина связывается с 1 моль ингибитсра);

50 вЂ” разведение сыворотки;

24000 вЂ” молекулярная масса трипсина;

0,5 вЂ” количество разведенной сыворотки в пробе.

Данные воспооизводимости предлагаемого метода исследования ингибиторов трипсина по исследованию сыворотки крови здоровых лиц приведены в табл.2.

Сравнительные даннь е содержания ингибиторов трипсина у 32 больных острым панкреатитом, полученные предлагаемым методом и известным, приведены в табл.3.

Формула изобретения

Способ определения ингибиторов трипсина в сыворотке крови путем добавления субстрата в исследуемую сыворотку, куда предварительно был добавлен трипсин, с последующим измерением оптической плотности, отличающийся тем, что, с целью повышения точности, в качестве субстрата используют азофибрин, а оптическую плотность измеряют в щелочной среде.

1675776

Таблица 3

Составитель Н. Теренина

Редактор М. Бланар Техред ММоргентал Корректор О. Кундрик

Заказ 2998 Тираж 388 Подписное

8НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Способ определения ингибиторов трипсина в сыворотке крови

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для прогнозирования эффективности микроволновой резонансной терапии

Способ диагностики сахарного диабета // 1675774

Изобретение относится к медицине, а частности к эндокринологии, и woxf т бить использовано для диагностики сахарного диабета

Способ прогнозирования течения инсульта // 1673979

Изобретение относится к области медицины и касается способов прогнозирования течения инсульта

Способ прогнозирования течения инфаркта миокарда // 1673978

Изобретение относится к медицине, в частности к кардиологии, и может быть использовано для прогнозирования течения инфаркта миокарда /ИМ/

Способ диагностики язвенной болезни двенадцатиперстной кишки // 1673977

Изобретение относится к области медицины и касается способов диагностики язвенной болезни

Способ дифференциальной диагностики нефролитиаза // 1673976

Изобретение относится к области медицины, в частности к уронефрологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики нефролитиаза

Способ диагностики интоксикации этилендиамином // 1672370

Изобретение относится к медицине, а именно к токсикологии, и может быть использовано в поликлинических и клинических условиях при периодических осмотрах работающих в контакте с этилендиамином

Способ диагностики инфекционных осложнений у детей с глубоким ожогом пищевода // 1672369

Изобретение относится к медицине, в частности к педиатрии, и может быть использовано при диагностике инфекционных осложнений у детей с ожогами пищевода

Способ определения активности калпаинов в биологическом материале // 1668950

Изобретение относится к биохимии

Способ определения активности холинэстеразы в крови и устройство для его осуществления // 1668949

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для контроля активности холинэстеразы в крови человека, в медицинской практике и токсикологии

Способ оценки эффективности замещения костного матрикса при трансплантации в ходе оперативного лечения костной опухоли // 2101708

Изобретение относится к медицине, а именно к ортопедии

Способ прогнозирования осложненного течения острого панкреатита // 2102764

Изобретение относится к области медицины, а именно к прогнозированию течения острого панкреатита

Способ дифференциальной диагностики клинических форм бруцеллеза у людей // 2103687

Изобретение относится к медицине, а, именно, к диагностике бруцеллеза цитохимическими методами

Способ оценки состояния больного // 2103692

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической биохимии и может быть использовано для диагностики и прогнозирования состояния больного в послеоперационном периоде и при развитии острого воспалительного процесса

Синтетические олигопептиды, специфически взаимодействующие с антителами к вирусу гепатита с, способы диагностики hcv- инфекции (варианты) // 2104284

Изобретение относится к медицине, молекулярной биологии и вирусологии и представляет собой биологически активные соединения - синтетические олигопептиды, соответствующие аминокислотным остаткам (а

Способ ранней диагностики послеродового эндометрита // 2104529

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для ранней доклинической диагностики послеродового эндометрита, одного из гнойносептических постгестационных заболеваний

Способ прогнозирования развития цилиохориоидальной отслойки после внутриглазной операции // 2104548

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может найти применение после внутриглазных операций для своевременного принятия профилактических мероприятий

Способ диагностики атрофического эндобронхита // 2104549

Способ определения эффективности иммуноцитотерапии у больных с опг-гестозами // 2105311

Изобретение относится к медицине, в частности к акушерству, и может найти применение в оценке эффективности терапии гестозов

Способ оценки завершенности формирования соединительнотканного рубца у больных, перенесших инфаркт миокарда // 2105983

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для установления завершенности патологического процесса при инфаркте миокарда (ИМ)