Способ определения активности холинэстеразы в крови и устройство для его осуществления

 

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для контроля активности холинэстеразы в крови человека, в медицинской практике и токсикологии. Цель - повышение точности и обеспечение автоматизации измерений. Цель достигается путем введения в реакционную смесь, состоящую из пробы цельной крови, трис-буфера и БАС - CL, в качестве тиохолинового субстрата дитиохолинового эфира пробковой кислоты и определения активности холинэстеразы по времени полного гидролиза субстрата с помощью специального устройства. Специальное устройство состоит из известного устройства, в которое дополнительно введены электрически управляемый дозатор, дифференциатор, делитель напряжения, блок памяти, компаратор. Устройство обеспечивает цифровую индикацию времени полного гидролиза субстрата. Изобретение позволяет повысить точность определения примерно в 10 раз. 2 с.п.ф-лы, 1 табл., 1 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

1668949 А1 (19) (I I ) »»:. „ I.

1 (sx)s G 01 N 33/68

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

00 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

0РИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

М» О

»»

Ф

I»

»

Ъ»

А в1 К1 60 10

7 .V-p

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4611890/14 (22) 17,10,88 (46) 07.08,91. Бюл. М 29 (72) В.А. Апухтин, В.Е. Горохов, Ю.А. Мазин, Т.А, Порхунова и В.А. Самокиш (53) 612.015(088.8) (56) Biochem. Pharmacol ., 1961, ч. 7, рр, 8895. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ В КРОВИ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ (57) Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для контроля активности холинэстеразы в крови человека, в медицинской практике и токсикологии, Цель — повышение точности и обеспечение автоматизации измерений. Цель достигаетИзобретение относится к биохимии и может быть использовано для контроля активности холинэстеразы в крови человека, в медицинской практике и токсикологии.

Целью изобретения является упрощение способа и повышение точности определения активности холинэстеразы в крови.

На чертеже представлена функциональная схема устройства для осуществления предлагаемого способа, Способ осуществляется следующим образом.

Приготавливают реакционную смесь, состоящую иэ трис-буфера рН 8,0 и БАС-CI (4,4-Бис-(1-гидрокси-8-хлор-3,6-дисул ьфо-2

-нафтилазо)дифенилдисульфид динатриевая соль, трехводная). Смесь помещают в кювету, добавляют пробу цельной крови человека, перемешивают встряхиванием, дося путем введения в реакционную смесь, состоящую из пробы цельной крови, трисбуфера и БАС-CL, в качестве тиохолинового субстрата дитиохолинового эфира пробковой кислоты и определения активности холинэстеразы по времени полного гидролиза субстрата с помощью специального устройства. Специальное устройство состоит из известного устройства, в которое дополнительно введены электрически управляемый дозатор, дифференциатор, делитель напряжения, блок памяти, компаратор, Устройство обеспечивает цифровую индикацию времени полного гидролиза субстрата, Изобретение позволяет повысить точность определения примерно в 10 раэ, 2 с.п. ф-лы., 1 ил., 1 табл. бавляют субстрат-дитиохолиновый эфир пробковой кислоты и фотометрируют. ° ВЮЮЪ

Пример 1. Для измерения активности Qh холинзстеразы в крови человека приготав- Q ливают оеакционную смесь, содержащую «р

3,0 10 M трис-буфера рН 8,0 и 1,2 10

M БАС-О. Эту смесь в обьеме 5 мл помещают в медицинский флакон, затем в нее + вводят 0,05 мл цельной крови человека и 0 перемешивают смесь встряхиванием, Кювету устанавливают в фотометрический блок, в реакционную смесь добавляют 1 мл 5 10 М дитиохолинового эфира пробковой кислоты и фотометрируют с помощью специального устройства.

Активность холинэстеразы в крови рассчитывают по формуле

1668949 где п11 — количество микромолей суберилдитиохолина. подвергшегося гидролиэу при анализе;

K> — температурный коэффициент, учитывающий зависимость измерений от температуры пробы (Ki==1, так как температура растворов + 25 C); — время гидролиэа субстрата, с;

V — объем цельной крови, вносимый в пробу.

В таблице представлены результаты измерения активности холинэстеразы в цельной крови предлагаемым способом.

Устройство для осуществления предлагаемого способа содержит измерительный блок 1, дозатор 2, дифференциатор 3, делитель 4 напряжения, блок 5 памяти, компаратор 6, регистратор 7, блок 8 запуска.

Измерительный блок 1 может быть выполнен, например, в виде фотометрической ячейки, содержащей источник света на лам1 пе МН 2,5  — 0,15 А и фотоприемник на фоторезисторе СФ вЂ” 2,5, в качестве разовых кювет используют медицинские флаконы.

Дозатор 2 выполнен в виде электрически управляемого автоматического дозатора, например медицинского доэатора А — 2 работающего в режиме разового дозирования.

Дифференциатор 3 выполнен по известной схеме на микросхеме с высоким сопротивлением входа, Делитель 4 напряжения, выполненный на двух резисторах, производит деление сигнала с заданным коэффициентом. Блок памяти 5 выполнен на конденсаторе К73ПЗ и микросхеме КР

544УДД!А, компаратор б — по известной схеме.

Трехразрядный регистратор 7 выполнен ho стандартной схеме с цифровым представлением информации. Блок 8 запуска представляет собой коммутационное устройство. выполненное на переключателях П2К.

Устройство работает следующим образом.

Для измерения активности холинэстеразы в крови человека приготовляют реакционную смесь, содержащую 3,0 10 M трис-буфера рН 8,0 и 1,2. 10 M БАС-C) (4,4-Бис-(1-гидро к си-8-х ло р-3. б-ди сул ьфо-2

-нафтилазо)дифенилдисульфид динатриевая соль, трехводная). Эту смесь в объеме 5 мл помещают в медицинский флакон, затем в нее вводят 0,05 мл цельной крови человека и перемешивают смесь встряхиванием. Кю вету устанавливают в измерительный блок

1, в реакционную смесь добавляют 5 10

М раствор дитиохолинового эфира пробке вой кислоты в объеме 1 мл посредством автоматически управляемого дозатора А-2, работающего в режиме разового дозирования, 5 При нажатии кнопки "Пуск на панели прибора электрическим импульсом через блок 8 запуска включается регистратор 7 одновременно с дозированием раствора субстрата, Перемешивание реагентов в

10 пробе осуществляется барботажем воздухом.

В ходе ферментативного гидролиза субстрата образуется тиохолин, вступающий в реакцию с хромогенным красителем

15 БАС-С!с образованием окрашенного продукта, Накопление окрашенного продукта вызывает увеличение оптической плотности раствора, что приводит к изменению сопротивления фоторезистора измери20 тельного блока 1 и уменьшению напряжения на входе дифференциатора 3, С его выхода продифференцированный сигнал подается на инверсный вход компаратора б и резистивный делитель 4. С выхода де25 лителя 4 половинное напряжение сигнала поступает в блок 5 памяти, где это половинное значение запоминается и используется в виде опорного напряжения, подаваемого на второй вход компаратора

30 6. В компараторе 6 происходит сравнение текущего сигнала производной с дифференциатора 3 с опорным сигналом с блока

5 памяти.

По окончании реакции полного гидро35 лиза происходит уменьшение текущего сигнала производной и в момент достижения равенства сигнала опорному напряжению на выходе компаратора 6 возникает сигнал "Стоп", останавливающий регистра40 тор 7. Время полного гидролиза в секундах считывается оператором с регистратора, Точность измерения активности холинэстераэы с помощью предлагаемого способа и устройства повышается примерно в

45 десять раэ по сравнению с известным, Формула изобретения

1. Способ определения активности холинэстераэы в крови по изменению оптической плотности реакционной смеси, 50 состоящей из пробы цельной крови, тиохолинового субстрата и хромогенного реагента, от л и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения точности определения, в качестве субстрата исполь55 зуют дитиохолиновый эфир пробковой кислоты, а в качестве хромогенного реагента используют БАС-Ct (4,4-Бис (1-гидрокси-8хлор-3,6-дисульфо-2-нафтилазо)дифенилдисульфид динатриевая соль), при этом активность фермента определяют по времени

1668949 прекращения изменения оптической плотности реакционной смеси, 2. Устройство для определения активности холинэстеразы в крови, содержащее измерительный блок, блок запуска и остановки, регистратор, о т л и ч а ю щ е е с я тем, что, с целью повышения точности определения активности холинэстеразы в крови в него введены дифференциатор, делитель напряжения, блок памяти, компаратор, электрически управляемый дозатор, выход которого соединен жидкостной

Среднее квадратическое отклонение д

Погрешность измерения активности Al;

Время полного гидролиза суберилдитиохолина т, с

Среднее арифметическое значение А1

Активность холинэстеразы в крови А1

Проба цельной крови

2,0

0,009

0,448

1,7

0,006

0,327

0,5

0,004

0,352

1,6

0,006

0.360

0.9

0,003

0,307

0,004

0,7

0,499

0,7

0,003

0,374

0.9

0,006

0,634

0,005

0,461

0,9

0,006

0,596

134

136

132

184

181

172

171

169

167

168

196

194

197

121

161

94

131

129 .130

101

101

0,448

0,441

0,454

0.324

0,326

0,331

0,349

0,351

0,355

0,359

0,364

0,357

0,306

0,309

0,306

0,500

0,496

0,500

0,375

0,375

0,373

0,632

0,632

0,638

0,458

0,465.

0,461

0,600

0,594

0,594 коммуникацией с входом измерительного блока, а вход — с первым выходом блока запуска, выход измерительного блока соединен с входом дифференциатора, выход

5 которого соединен с.первым входом компаратора и входом делителя напряжения, выход которого соединен с входом блока памяти, выход которого соединен с вторым входом компаратора, выход которого

10 соединен с первым входом регистратора, второй вход которого соединен с вторым выходом блока запуска.

1668949

Составитель Т,Малютина

Техред M.Mîðãåíòàë Корректор M.Äåì÷èê

Редактор И.Шуллэ

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Заказ 2654 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская нэб., 4/5