Штамм гриба аrтнrовотrys digospora fres. для получения препарата против галловых нематод
С(1Н1З СОВГ- !СКИХ
C01!I4A!1I1C1FI1ЧЕ СКИХ
РЕСI1YБЛИK
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ KOiVINT ET ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ABTOPCKGMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4634132/13 (22) 30.06.88 (46) 07.11.91. Бюл, М 41 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт охраны природы и заповедчогодел;- Госагропрома СССР, Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии Научна-производственного обьединения "Вектор" и Всесоюзный научно-исследовательский институт биометодов защиты растений ВАСХНИЛ (72) T.ÂÕåïëÿêoâà. Н.В.Мацкевич, Г.Л.Шатрова и Л.Н.Налепина (53) 632.951 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР Мг 1264393, кл. А Oi N 63/00, 1983. (54) ШТАММ ГРИБА ARTHROBOTRYS OLIGOSPORA FRES. ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ПРОТИВ ГАЛЛОВЫХ НЕМАТОД Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению биологических средств для борьбы с галловыми нематодами, и представляет собой новый штамм для полу о.ния вышеуказанного средства. Целью изобретения является получение нового штамма нематофэгового хищного гриба вида Arthrobotrys oligospora Fras., обладающего более высокой активностью в привлечении и уничтожении галловых нематод и стабильностью. Штамм гриба Arthrobotrys оИцозрога FrBs. выделен из почвы березового насакдения в окрестнос1ях пос. Краснообск Новосибирской обл, и депонирован во Всесоюз„„SU„„1688818 А1 (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению биологических средств дг,я борьбы с галловыми нематодами, и представляет собой новый штамм для получения вышеуказанного средства. Целью изобретения является получение нового штамма нематофагового хищного гриба вида Arthrobotrys ой9о-pora Fres., обладающего более высокой активностью в привлечении и уничтожении галловых нематод и стабильностью, Использование препарата позволяет снизить численность нематод в почве на 27— 35 4 по сравнению с препаратом, полученным на основе известного штамма. 5 табл, ной коллекции микроорганизов Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР под номером ВКМ F — 3062 Д. Штамм имеет следующие культуральноморфологические и физиолого-биохимические признаки. На сусло-агаре образует колонии, имеющие белый, ватообразный мицелий, плотность которого по поверхности колонии неравномерна вследствие образования небольших впадин. Обратная сторона колоний коричневого или светлокоричневого цвета. Конидиеносцы простые, с 1 — 2 узлами на вершине. Конидии размером 27.2 х 15,1 мкм, удлиненно грушевидные, двухклеточные, собраны в головки по шесть и более 1688818 конидий, Ловчие органы в виде петель, колец и их сплетений могу образовываться спонтанно на n«iательной среде. Присутствие нематод стимулирует массовое образование колец. В табл.1 предст;влены данные по скорости роста штамма ВКМŠ— 3062 Д на разных средах при температуре 20 С. Отношение к источникам углерода. Штамм использует различные вещества и субстраты; моносахара (глюкоза, арабиноза), дисахара (лактоза, мальтоза, сахароза), трехатомный спирт (глицерин), многоатомные спирты (маннит, дульцит, инозит, сорбит, рамноза), полисахарозы (крахмал), жиры (растительное масло, рыбий жир, олеиновая кислота), Лучший рост отмечается в присутствии глюкозы, сахароэы, глицерина. крахмала, а также комплексных источников углерода (пивное сусло, меласса). Отношение к источникам азота, Штамм использует почти все аминокислоты: аланин, валин норлейдин, лейцин, сорин, аргинин, лизин, орнитин, аспарагии, глутамин, фенилаланин, гистидин, триптофан, метионин, цистеин. Аланин, аспарагин, метионин и триптофан стимулируют наибольший выход биомассы гриба, а норлейцин— образование ловчих петель. Штамм способен использовать азот из неорганических источников — азотнокислого и хлористого аммония. Кукурузный экстракт, включающий комплекс аэотсодержащих соединений, является наилучшим источником азота для этого гриба. Для выращивания гриба в поверхностной культуре можно использовать сусло-агар, пептонно-кукурузный агар и др, Оптимальная температура для культивирования штамма 25 — 26 С, минимальная 5 — 6 С, максимальная 29 — 30 С. Штамм BKMF — 3062 Д маркерных признаков не имеет, Хранится штамм на агаризованной среде (ПКА и СА) в пробирках при температуре 4 — 5 С в течение года. Для контроля за состоянием популяции проводится микроскопический контроль культуры за наличие ловчих приспособлений. Для этого при малом увеличении микроскопа просматривают препараты, полученные путем захвата культуры в разных местах колонии микробиологической иглой над пламенем спиртовки. Для стабилизации свойств штамма 1 — 2 раза в год проводится моноконидиальный рассев, при котором изотвитыхиэолятов(не менее 100) производится отбор культур не только с характерными морфологическими признаками, но и с количеством ловушек не менее 10 в поле зрения микроскопа при увеличении 90". Штамм характеризуется стабильностью нематофаговых свойств. 55 бой субстрат (подсолнечную лузгу), частицы которого покрыты спорами и мицелием гриба. Основой препарата являются конидии и мицелий хищных грибов в виде Arthrobo.гуз оИоозрога Fres, В 1 кг прегарата содержит15 Пример 1. Получают препарат против галловых нематод. Исходная культура воспроизводится на дозированном скошенном сусло-arape (3,5 Бел.) в молочных бутылках в течение 7 — 10 сут при температуре, оптимальной для используемого штамма. В конце роста культуры выставляют на рассеянный солнечный свет, стимулирующий соотношение, после чего их можно хранить до 6 мес. в холодильнике и периодически использовать в качестве инокулюма для получения маточных культур, Маточную культуру выращивают глубинным способом в колбах Эрленмейера на круговых качалках, делающих 220 об/мин, или в ферментерах на жидкой среде следующего состава, г: кукурузный экстракт 0,75; меласса свекловичная 3,0; КНИЖНО 0,5; М930л 7НрО 0,2, МаМОз — 0,5, вода водопроводная 1000 мл, рН среды доводят до 7,0, Культуральные емкости засевают спорово-мицелиальной суспензией, для получения которой в каждую молочную бутылку с исходной культурой гриба добавляют 100 мл стерильной воды, после чего бутылку энергично встряхивают, а суспенэию используют по назначению. Соотношение объемов суспензии и культуральной среды равно 1:10 — 1;20. Ферментацию маточной культуры осуществляют в течение 3 сут. Выход биомассы по сухому веществу составляет 12 — 15 г/л, Для производства биопрепарата подсолнечную луэгу, помещенную на сетку, промывают струей проточной воды. После ее стекания в течение 2 ч влажность субстрата становится равной 55 — 60%, Лузгу распределяют па различным емкостям (стеклянные банки объемом 1 — 3 л), заполняя их на 2/3 объема. Банки закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилиэуют в течение 1 ч при 1 атм. Посев глубинной (маточной)культуры на подготовленный субстрат проводят стерильно по 10 — 20 мл в банки емкостью 1 л и по 50 мл в трехлитровые банки. Затем банки тщательно встряхивают и помещают в горизонтальное положение в термостат при 25 — 28 С на 10— 12 дней. В последние два дня их выставляют на солнечный свет, Сушат биоп репарат при температуре не более 30 С, хранят его в бумажных мешках при температуре 24 — l8 С в течение 6 мес. Полученный биопрепарат представляет со10 <,,< ся не менее 2 — 5x10 ».из,геr.ïîñîÜ ь<х конидий и 98% субстрата. Биопрепарат, изготовленный описанным способом, рекомендуется против галловых нематод, пора>каюв.их овощные культуры в защищенном грунте. Пример 2. Применение препарата в лабораторных условиях, Аттрактивная способность, являющаяся составной частью механизма хищничества нематофаговых грибов, у данного штамма проявляется значительно сильнее, чем у штамма BKMF— 2461 Д. В лабораторном эксперименте на аттрактив,blA и нематофаговый эффект использовали культуры сравниваемых штаммов, выращенные на агаризсванной питательной среде (сусло-агар. пептоннокукурузный агар). В чашечки Г!етри диаметром 30 мм вносили суспензию нематод Panagrellus redivi из G. В центр чашечки помещали высечки культур грибов диаметром 3 4м. При помогци стереоскопического микроскопа проводили наблюдения за перемещением нематод в блок культур гриба и через 2 ч проводили их подсчет (см. табл.2), В лабораторных условиях гибель нематод у штамма ВКМГ- — 3062 Д наступает быстрее, 100%-ная гибель в указанном эксперименте наблюдалась через 1 сут, а у штамма ВКМà — 2461 Д вЂ” через 2 сут. Данные электронно-микроскопического исследования свидетельству от о присутствии мицелия штамма BKMF — 3062 Д в теле нематод уже через 12 ч, Предлагаемый штамм BKMF — 3062 Д характеризуется большей стабильностью и активностью câoéñòâ по сравнению со штаммом BKMF — 2461 Д. При работе со штаммом BKF — 2471 Д обнаружено появление в колониях секторов и пятен, в то время как морфология колоний предлагаемого штамма с момента выделения из природы при пересевах остается rioстоянной. Проведение цитокариологического анализа в процессе онтогенетического развития этих штаммов с помощью окраски НС— Гимза показало, что базальные клетки конидиеносцев и конидий штамма BKMF — 2461 Д преимущес венно многоядерны, а ядра различаются по форме и величине, а между клетками конидиеносцев и гифами мицелия обнаружено наличие анастомозов. D отличие от этого у штамма BKMF — 3062 В преобладает одноядерность базальных клеток конидиеносцев и конидий, не обнаружены анастомозы между клетками конидий и гифами мицелия. Эти данные вскрывают причину нестабильности штамма BKMF — 2461 Д, vùорая зз< л<очао сл в гетс р;<карие пи.<о сти базальных клеток конидие!<овцев Ll Kt) нидий. В отличие от предлагаемого штамма BKMf- 3062 Д, которыи обладает up»pop«!.!ми свойствами активности и стабильности, штамм BKMF — 2461 0 получен многоступенчатым моноконидиальным отбором и является по сути искусстBåнным штаммом, который сохраняется без изменения 5 лет. Для успешного применения хищных грибов в качестве продуцентов биопрепарата для борьбы с галловыми нематодами необходимо изучение их свойств не только в лабораторных условиях, но и в почве. r.е, в условиях практического использования штаммов. Для изучения поведения предлагаемого штамма и известного в почве использовали метод мембранных камер, суть которого состоит в том, что на миллипоровые фильтры наносится суспензия спор исследуемых штаммов грибов, фильтры закладываются в камеры (из стеклоткани) и помещаются в почву, В динамике (после фиксации и окрашивания фильтров карболовым эритрозином) проводится подсчет на фильтрах ло-. вушек хищных грибов и формирующихся в почве хламидоспор. Данные представлены в табл.3. Как видно из табл.3, в почве к 14-м сут у штамма BKMF — 3062 Д число ловушек в шесть с лишним раз превышает таковое у штамма BKMF — 2461 Д, а резкое возрастание к концу месяца числа хламидоспор свидетельствует о лучшей адаптации предлагаемого штамма к условиям почвы и приживаемости в ней. Пример 3. Применение препарата в полевых условиях, Эффективность препарата на основе штамма BKMF — 3062 Д была подтверждена в условиях производственного опыта в теплице на растениях огурца сорта "Эстафета — 87", Опыт был заложен 18 февраля 1988 г. и продолжался до 29 сентября того же года, Воздушно-сухой препарат на подсолнечной лузге на основе штаммов BKMF — 2461 Д и BKMF — 3062 Д вносили в дозе 50 r на 1 кв.м. Варианты опыта: биопрепарат на основе штамма BKMF — 2461 Д; биопрепарат на основе штамма BKMF— 3062 Д; контроль (чистый); контроль (применение нематоцида гетерофоса), После окончания опыта проведен анализ корневой системы растений на наличие галлов по пятибалльной шкале и проведен подсчет численности нематод в почве. Данные представлены в табл.4 и 5. Как видно из табл.2 и 3, биопрепарат на основе штамма ВОЛà — 3062 D оказался болееактив1688018 Таблица 1 54 83 42 46 CA ПКЛ ч П р и M е ч ан и е. CA — сусло-агар (5 Бел); ПКАО, пептонно-кукурузный агар, г/л: гликоза 10; хлористый натрий 5; углекислый кальций 0,5; кукурузный экстракт 5; пептон 5; агарагар 20; Ч вЂ” среда Чапека, г/л . сахароза 30, азотнокислый натрий 2; сернокислый магний 0,5; сернокислое железо 0,01; хлористый калий 0,5; .калий фосфорнокислый однозамещенный 1; агар-агар 20. Таблица 2 BKM1 -2461Л В KNF-306 2Л Таблица 3 733 827 1558 51 73 716 36 309 78 109 14 30 ным в уничтожении нематод, Снижение численности нематод в почве по отношению к чистому контролю составило у биопрепарата на основе штамма BKMF — 2461 Д 59,4%, на основе штамма BKMF — 3062 Д вЂ” 86,2%. По отношению к контролю с гетерофосом соответственно 46,5% и 81,9%. Таким образом, предлагаемый штамм превосходит известный на 27 — 35% по способности уничтожать личинок нематод в почве. Формула изобретения 5 Штамм гриба Arthrobotrys ollgospora Fres,BKMF 3062 Д для получения препарата против галловых нематод. 1688818 Tа блица 4 Биопрепарат на основе штамма ВКИЕ-2461 Д Биопрепарат на основе штамма ВК((Е-3062 Ц Контроль (чистый) Контроль (с гетерофосом) 3-, 7 43,1 1 9 2,2 42,4 Та блица 5 46,5 4(7 Ь 53,5 71,3 81,9 86,2 18,1 13,8 131,8 100 175,8 133,4 100 24,2 75,8 Редактор А. Мотыл ь Заказ 3759 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Биопрепарат на основе штамма BKNF-2461 Д Биопрепарат на основе штамма BKMF-3062Д Контроль (чистый) Контроль (с гетерофосом) Составитель Н.Мцхветаридзе Техред М.Моргентал Корректор О.Кравцова
