Питательная среда для культивирования личинок тriснinеllа spiralis

 

Изобретение относится к гельминтологии , а именно к питательным средам для культивирования личинок ;ельминтов. Цель изобретения - повышение сроков сохранения жизнеспособности личинок. Поставленная цель достигается гем, что в состав среды входят тиамин бромид, раствор полиглюкина , твин-20, твин-80, человеческий сухой альбумин, раствор Хенкса без фенола. Простота изготовления и доступность ингредиентов среды, наряду с ее высокой биологической полноценностью, позволяют применить ее в широкой гельминтологической практике. 1 табл.

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ВесОЯф@

8ATNTH9- TBNf le

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4764903/13 (22) 12.12,89 (46) 07.11.91, Бюл. N. 41 (71) Ростовский научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии, паразитологии и гигиены (72) А.П.Ордынцева, А.П.Шепелев, Е,В,Уразовская „Г.Н.Сы рова и С. Г,Благо родо в (53) 576.8.093.33:576,893.132(088.8) (56) Материалы докладов 2-й Всесоюзной конференции по проблеме трихинеллеэа человека и животных. 1976, с. 209 — 213.

Изобретение относится к гельминтологии, а именно к питательным средам для культивирования личинок гельминтов, Цель изобретения — повышение сроков сохранения жизнеспособности личинок.

Пример 1. В асептических условиях к

500 мл стерильного стандартизированного раствора Хенкса нейтрального (без фенола) прибавляют 0,02 — 1,0% ампулированного

6%-ного раствора бромида тиамина. К полученной смеси добавляют 0,2- 5,0% стандартного стерильного раствора полиглюкина, смешивают и в полученной смеси растворяют

100,0 — 5000,0 мг сухого человеческого альбумина. Затем к раствору прибавляют (0,01—

0,1)% твина-20 и твина-ЯО. Смесь доводят до объема 1 л раствором Хенкса нейтрального (без фенола).

Полученную рабочую среду стерилизируют с помощью уста юв 1дл Г ерилизую Ы, 1689399 А1

fsi) s С 12 N 1/00 А 01 К 67/033 (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЛИЧИНОК TRICHINEI LA

SP IRALIS (57) Изобретение относится к гельминтологии, а именно к питательным средам для культивирования личинок гельминтов. Цель изобретения — повышение сроков сохранения жизнеспособности личинок, Поставленная цель достигается тем, что в состав среды входят тиамин бромид, раствор полиглюкина, твин-20, твин-80, человеческий сухой альбумин, раствор Хенкса без фенола. Простота изготовления и доступность ингредиентов среды, наряду с ее высокой биологической полноценностью, позволяют применить ее в широкой гельминтологической практике. 1 табл. щей фильтрации типа "Миллипор" с диаметром фильтрующей поверхности 142 мм.

Фильтрацию под вакуумом в 0.5 атм производят в течение 30 мин через микропористые капроновые стерилиэующие мембраны с размером flop 0,2 мкм (рН среды 7,8 — 8,0), Срок хранения питательной среды при 5 С4-5 мес.

Моделью для культивирования гельминта служат личинки 7richiflella splralis, выделенные от инвазированных белых мышей путем переваривания мышечной ткани в искусственном желудочном соке следующего состава; медицинский пепсин 30 г; концентрированная соляная кислота 10 мл; физиологический раствор до 1 л. Выделенные личинки трихинелл после отмывания в стерильных растворах питательной среды в асептических условиях помещают в рабочую питательную среду и инкубируют в

1689399 асептических условиях при,37 С в течение

25-27 дней. Биологическая полноценность питательной среды для культивирования личинок трихинелл определяется по сохранению жизнеспособности и инвазионных свойств личинок. Оценка жизнеспособности личинок трихинелл производится с помощью микроскопического исследования характера поведенческих реакций, двигателей активности, размеров тела и его формы.

Оценка инвазионной способности у инкубированных личинок трихинелл производится с помощью биопробы на белых беспородных мышах обоего пола весом 18 — 20 г при дозе заражения 80 личинок трихинелл на 1 особь. Приживаемость трихинелл определяют через 2, 3, 5, 7, 10, 12, 15 и 20 дней инкубации, Вскрытие животных производят на, 3-й день после зара>кения, Пример 2, Питательная среда с минимальным значением концентрации входящих ингредиентов, количество ингредиентов в % к объему.

Раствор бромида тиамина (6%-ный) 0,02

Раствор полиглюкина 0,2

Твин-20 0,01

Твин-20 G,01

Человеческий сухой альбумин (мг) 0,01 (мас, %)

Раствор Хенкса нейтральный (без фенола) До 100 (до 1 л)

Приготовление питательной среды для культивирования личинок трихинелл осуществляют аналогично примеру 1.

Результаты оценки биологической полноценности среды при культивировании личинок трихинелл представлены в таблице.

Длительность сохранения жизнеспособности личинок трихинелп в питательной среде с минимальным значением концентрации входящих ингредиентов составляет

15,0 — 1,3 сут, У большинства личинок трихинелл на

2-3-е сутки их культивирования отмечалось увеличение размеров тела. В течении 8 сут у личинок трихинелл наблюдается выраженная двигательная реакция (свободное плавание в среде, хаотическое движение тела).

У части личинок отмечается снижение двигательной активности и сворачивание тела в плотное кольцо. На 9 — 10-е сутки появляются личинки с серповидной формой тела, характерной для погибших личинок. Полное исчезновение подвижности личинки и их

100%-ная гибель проявляется на 15 — 18-е сутки инкубации.

При исследовании целостности кутикулы личинок трихинелл в поле зрения микро5

1,0

L скопа при увеличении (90х7) нарушений ее целостности не обнаруживается, Приживаемость личинок трихинелл у белых мышей на 2 — 3-й день инкубации составляет 26,4-1,3% против (34,7+0,9 ) % в контроле (p< 0,05).,На 5-й день инкубации приживаемость инкубированных личинок трихинелл составляет (18,0+1,1 ) %, на 7-й день — (10,8+4,7) % при р <0,05, Пример 3, Используют питательную среду с оптимальным значением концентрации входящих ингредиентов следующего состава, количество ингредиентов в % к объему:

Раствор бромида тиамина (6%-ный) 0,1

Раствор полиглюкина 1,0

Твин † 0,05

Твин-80 0,05

Человеческий сухой альбумин (мг ) 0,05 (мас.%)

Раствор Хенкса нейтральный (без фенола) До 100 (до 1л)

Приготовление питательной среды и ее применение аналогичны примеру 1, Результаты оценки биологической полн оцен ности среды представлен ы в таблице.

Сохранение жизнеспособности личинок трихинелл при их культивировании в среде с оптимальным значением концентрации ингредиентов составляет 21,4+2,6 дня.

В течение первых 2 — 4-х суток у них отмечается увеличение размеров до 1,4 мм у самцов и до 1,56 мм у самок, Высокая двигательная активность (свободное плавное в среде, хаотическое движение, у отдельных особей наблюдается явление капуляции, Подвижность личинок сохраняется в течение 16 — 18 дней инкубации. Погибшие личинки (серповидная форма тела) появляются на 18 — 20-й день и составляет

21 — 30% Соответственно 100-ная гибель отмечается лишь на 25 — 26-й день инкубации.

Нарушений целостности кутикулы у погибших ЛТ не обнаруживается, Приживаемость личинок у белых мышей на 3-й день инкубации составляет 28,8% против 34,7% в контроле, на 5 — 10-й день

21,2-18,3%, на 15-й день 16,1%, на 20-й день

10,5%.

Пример 4, Используют питательную среду с максимальным значением концент; рации входящих ингредиентов следующего состава, концентрация ингредиентов в % к объему;

Раствор бромида тиамина (6%-й) 1,0

Раствор полиглюкина 5,0

Твин-20 0,1

1689399

Формула изобретения

Среда

Сроки сохранения жизнеспособности, J ни

Питательная среда с минимальным значением концентрации входящих ингредиентов

15,0+ 1,3

Питательная среда с оптимальным значением концентрации входящих ингредиентов

21,4+ 2.6

Питательная среда с максимальным значением концентрации входящих ингредиентов

11,7+ 0.7

Среда НС - 115

1 2,0

Составитель А.Федотов

Редактор И,Дербак Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор М.Максимишинец

Заказ 3787 Тираж ° Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно и..издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Га арин», 101

Твин-80 0,1

Человеческий сухой альбумин (мг) 0,5(мас. )

Раствор Хенкса нейтральный (без фенола) До 100 (до 1л)

Приготовление питательной среды и ее применение осуществляются, аналогично примеру 1.

Жизнеспособность личинок трихинелл в среде с максимальным значением концентрации ингредиентов сохраняется в течение

11,7+0,7 дней инкубации.

В первые сутки культивирования личинок отмечается более выраженная подвижность, чем при культивировании в среде с минимальной и оптимальной концентрацией ингредиентов, сохраняющаяся в течение 4 — 5 сут (при р < 0,05). У части личинок на

8-9-е сутки наблюдается снижение подвижности, сворачивание тела в кольцо. у 22 появляется серповидная форма тела. 100 ная гибель личинок отмечается на 11 — 12-й день наблюдения.

Приживаемость личинок трихинелл у белых мышей на 3-й день инкубации составляет 18,1, на 5-й день 12,3 .

Таким образом, питательная среда для культивирования личинок Тг!сЫпеПа spfralis при оптимальной концентрации входящих ингредиентов обладает высокой биологической полноценностью, обеспечивая более длительное сохранение жизнедеятельности личинок, чем при применении среды НС175 (на 57,1 ). Снижение или повышение

5 концентрации входящих ингредиентов снижает сроки сохранения жизнедеятельности.

10 Питательная среда для культивирования личинок Trichinella spiralis, содержащая источник белков, углеводов, витамины и минеральные соли, отличающаяся тем, что, с целью повышения сроков сохранения

15 жизнеспособности личинок, она дополнительно содержит твин-20 и твин-80, в качестве источника белка — человеческий альбумин, в качестве источника углеводовполиглюкин, в качестве минеральных солей

20 — раствор Хенкса, в качестве витаминов—

6%-й раствор тиамина бромида при следующем соотношении компонентов, об. :

6%-й раствор тиэмина

6ромида 0,02 — 1,0

25 Полиглюкин 0,2-5,0

Твин-20 0,01 — 0,1

Твин-80 0,01 — 0,1

Альбумин человеческий 0,01 — 0,5

Раствор Хенкса, До 100