Консорциум штаммов бактерий рsеndомоnаs sp. и метнylовасillus метнаnоlоvоrus, разлагающий метилацетат

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4759597/13 (22) 28.08.89 (46) 30.10.91, Бюл. М 40 (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР и Институт микро.биологии и вирусологии АН КазССР (72) Д.Ю.Раков, Н.В.Доронина, Ю,А.Троценко и P M.Алиева (53) 663.15 (088,8) (56) Бюлер Н., Пирсон Д. Органические синтезы. Ч. 2, M.; Мир, 1973, Вейганд-Хильгетач. Методы эксперимента в органической химии, М.: Химия, 1968. (54) КОНСОРЦИУМ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ

PSEUDOMONAS SP. И METHYLOBACILLUS

METHANOLOVORUS, РАЗЛАГАЮЩИЙ МЕТИЛАЦЕТАТ (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается нового консорциума штаммов бактерий, который может быть использован при биологической очистке сточИзобретение относится к биотехнологии и касается нового консорциума штаммов бактерий, который может быть использован при биологический очистке сточных вод ацетальдегидного производства.

Метилацетат (метиловый эфир уксусной кислоты) — летучий высокотоксичный синтетический поллютант, химически устойчивый при нормальных условиях. В патентной и научно-технической литературе нет сведений о микробной деградации этого соединения.

„„. Ы„„ 1687608 Al (я)5 С 12 N 1/20, С 12 S 13/00 ных вод ацетальдегидного производства.

Цель изобретения — консорциум штаммов бактерий, полностью разлагающий метилацетат. Консорциум бактерий полностью разлагает метилацетат, используя продукты его гидролиза — метанол и ацетат — в качестве источников углерода и энергии, при концентрации до 5 г/л в течение 15—

36 ч. В качестве деструктора метилацетата используют штамм факультативно-метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. ВКМ

В-1735Д, обладающий карбоксилэстеразой, совместно со штаммом IVlethylobacillus

methanolovorus BKM В-1447Д, облигатно использующим метанол. Штамм Pseudomonas

sp, выделен из сточных вод ацетальдегидного производства в Казахской CCP. Штамм )

Methylobacillus methanolovorus выделен из активной коры очистных сооружений целлюлозно- бумажного комбината Эстонской

ССР, Консорциум используют при соотношении штаммов 2:1; 1 табл.

Цель изобретения — новый консорциум штаммов бактерий, полностью разлагающий метилацетат, Изобретение заключается в том, что в качестве деструктора метилацетата используют консорциум, состоящий из штамма факультативноо-метилотрофных бактерий

Pseudomonas sp. 24 RA, обладающих карбоксилэстеразой, и штамма Methylobacillus

methanolovorus BKM В-1447Д. облигатно использующего метанол.

Консорциум бактерий полностью разлагает метилацетат, используя продукты его ки. гидролиза (меIàuoë и ацета ) в качестве источников углерода и энергии, Штамм Pseudomonas sp. 24 RA выделен иэ с1очных вод ацегальдегидного производства в Казахской ССР, (Итамм имеет следующие карактеристиМорфолого-культуральн ые признаки.

Клетки — бесцветные подвижные палочки 0,5--0,7 х 1,3-1,7 мкм с одним полярным жгутиком, грамотрицательные, неспорообраэующие, не имеющие сложных внутрицитоплазматических мембран, подобных метанотрофным бактериям. Не имеют простек. Размножаются делением пополам, образуют полярно расположенные пили.

Колонии на МПА до 5 мм в диаметре, округлые, непрозрачные, с ровным краем, белые, поверхность гладкая, профиль выпуклый, структура однородная, консистенция вязкая.

Физиолого-биохимические признаки.

Азроб, растет при 10 — 39 С, оптимум 28—

32 С. Оптимум рН 6,8-7,2, при рН 3,6 не растет.

Флюоресцирующие пигменты, пиоционин, каротиноиды не образует. Имеет оксидазу, каталазу, аргининдигидролазу, Нитраты восстанавливает в нитриты.

Леван из сахарозы, ацетоин, индол, ацетилметилкарбинол не образует. )Келатин, целлюлозу, поли- Р -оксибутират не разлагает, но гидролиэует крахмал и твин-80. Поли- Р -оксибутират внутриклеточно не накапливает. DL

Р -оксибутират не использует в качестве источника углерода в недостаточной по азоту среде.

Источниками углерода для роста служат формиат, метанол или этанол при низких концентрациях (0,05-0,1 ), метилацетат, этилацетат, этилформиат, бутилацетат, изопропанол, иэобутанол, а-арабиноза, фруктоза. а -рамноза, О-рибоза, D-ксилоза, глюкоза, сахароза, О-серин, ацетат, бетаин, саркозин, глицин, фумарат, сукцинат а-кетоглютарат.

Среду с глюкозой подкисляет, газообразование отсутствует. Глюкозу анаэробно не ферментирует. Рост не обеспечивают формальдегид, метиламин, триметиламин, этиламин, трегалоэа, /3 -аланин, L-серин, фенилаланин, DL-аргинин, глиоксилат, и-оксибенэоат, M îêñèáåíçîàò, мезоинозит.

Не растет автотрофно в атмосфере

C02 + H2 + 02. В качестве источников азота использует соли аммония, нитраты и некоторые аминокислоты. В ростовых факторах не нуждается.

ГЦ м,llll, " ДНК ((<.;) 6(,».

П(1амм Мейу(о(>а<:illus п1е(!no(nvorus

ВМК В-1447Д вь делен из активной коры очистных сооружений целлюлозно-бумажного комбината Эстонской ССР и имеет следующие характеристики.

Морфолого-культуральные признаки.

Бесцветные подвижные палочки 0,5 х х2 мкм с одним полярным жгутиком, грамотрицательные. Спор и капсул не образуют, не имеют сложных внутрицитоплазматических мембранных структур, размножаются делением пополам.

Колонии на минеральной агаризованной среде с метанолом в качестве источника углерода и энергии — округлые, выпуклые, бесцветные, гладкие, до 1 мм в диаметре, край ровный. структура однородная, консистенция вязкая.

Физиолого-биохимические признаки.

Облигатный аэроб, оптимальная температура для роста 35 С, оптимум рН 6,8 — 7,4, Облигатный метилотроф, использует метанол в качестве источника углерода и энергии, не способен к росту на средах с полиуглеродными и другими одноуглеродными субстратами. Источниками азота служат соли аммония или нитраты. В дополнительных факторах роста не нуждается.

В присутствии 0,50 -ного метанола в среде гидролизует крахмал, клетчатку не разрушает, сероводород, индол, ацетоин не образует, желатину не разжижает. Катало-, уреаэо-, оксидазоположителен. Нитраты восстанавливает до нитритов. Использует метанол через 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатный вариант рибулоэомонофосфатного цикла фиксации формальдегида.

Гц моль ДНК (Тп ) — 52,2.

Тип взаимодействия между штаммами в консорциуме при использовании метилацетата симбиотический, Штамм Pseudomonas

sp. BKM В-1735Д обладает карбоксилэстеразой, катализирующей гидролиз эфирной связи метилацетата с образованием метанола и ацетата. Ацетат ассимилируется этим штаммом через цикл трикарбоновых кислот и глиоксилатный шунт (изоцитратлиаэу и мал атси нтаэу). М етанол асс имил ируется

Pseudomonas sp. ВКМ В-1735Д через сериновый путь С(-метаболизма, однако использование метанола лимитируется низкой активностью алкогольоксидаэы, Метанолдегидрогенеза (ФМС, НАД) у данного штамма отсутствует. В результате культура

Pseudomonas sp. ВКМ В.1735Д при росте на среде с высокой концентрацией метилацетата (более 2 г/л) активно потребляет один из продуктов его деградации — ацетат, а метанол постепенно накапливается в среде

1687608 и начинает ингибировэть дальнейшее расщепление метилацетата.

Methylobacilius methanolovorus 8 KM В1447Д вЂ” облигэтный метилотроф, обладающий метанолдегидрогеназой (ФМС) и активно ассимилирующий метанол.

Methylobacillus methanolovorus ВКМ В1447Д не ингибируется метилацетатом, но не имеет карбоксилэстеразы и не может использовать метилацетат в качестве источни- 1 ка углерода и энергии.

При совместном культивировании

Pseudomonas sp. BKM В-1735Д и

М.methanolovorus BKM В-1447Д достигается полная утилизация метилацетата. 1

Получение консорциума, Консорциум может быть составлен из суспензии клеток Pseudomonas sp. BKM В1735Д, выращенной на среде "Д" с 2 г/л метилацетата, и суспензии МетЬу!оЬасИЬз 2

methanolovorus ВКМ В-1447Д, выращенной на среде "К" с 5 г/л метанола, в соотношении при равной плотности суспензий соответственно 2:1. При изменении этой пропорции (в пределах 0,5:1 — 4:1) в начале 2 культивирования консорциума на метилацетате штаммы в процессе роста постепенно достигают оптимального соотношения клеток (2:1). Это обусловлено тем, что рост облигэтного метилотрофа Methylobacillus 3

methanolovorus BKM В-1447Д лимитирован метанолом, образующимся при разложении метилацетата штаммом Pseudomonas sp, ВМК В-1735Д.

Состав среды "Д", г/л дистиллирован- 3 ной воды; (NH4) Н2Р04 1,0

Kz HP04 1.0

NaС! 5,0

М9$04 7 Н20 0,2

FeSO4 7 HzO 0,004

Среду по 100 мл стерилизуют в колбах на 750 мл при 1 атм 30 мин. После засева

30 мл суспензии вносят 2 г/л метилацетата и закрывают колбы резиновыми пробками 4 для предотвращения испарения метилацетата.

Культуру Pseudomonas sp. ВКМ В-1735Д выращивают на качалке при 180 об/мин при

30 С втечение 30ч. 50

Состав среды "К", г/л дистиллированной воды:

KHzP04 2,0 (NH<)z $04 . 2,0 5

MgSO4 7 Н20 0,175

FeSO4 7 Н20 0,002 рН 7,2 доводят раствором NaOH. Среду стерилизуют при 1 атм 30 мин.

Культуру Methyiohaciliu.; тн ih: по!о л ц .

BKM В-1447Д выращивают в колбах и»

750 мл с 200 мл среды и 5 г/л метанола на качалке при 180 об/мин при 30 С в течение

5 24ч.

Условия хранения консорциума и составляющих его штаммов, Консорциум сохраняют на жидкой среде "Д" при 4 С и производят пересевы через

0 каждые две недели, при этом культура сохраняет высокую биохимическую активность.

В лабораторных условиях культура

Pseudomonas sp. ВКМ В-1735Д поддержи5 вается на косяках с МПА и пересевается через две недели, культура Methylobacillus

methanolovorus BKM В-1447Д поддерживается на агаризованных (2 ) косяках со средой "К" и 0,5 (об/об) метанола и переО севается один рэз в месяц.

Штаммы Pseudomonas. sp. BKM В1735Д и Methylobaclllus methanolovorus

BKM В-1447Д хранятся в лиофильно высушенном состоянии, защитная среда — моло5 Ко, при этом свойства штаммов устойчивы.

Пример. 30 мл суспензии 10 кл/мл, выросшей на среде с:метилацетатом двухсуточной ассоциации культур Pseudomonas

sp. В КМ В-1735Д и Methylobacillus

0 methanolovorus ВКМ В-1447Д высевают в колбы со средой "Д". В качестве источника углерода и энергии вносят 5 г/л метилацетата. Культивирование осуществляют на качалке при 180 об/мин при ЗО С. Количест5 венный газохроматографический анализ культуральной жидкости на содержание метилацетата, метанола и ацетата проводят через каждые 3 ч в течение 36 ч культивирования.

40 Контроль за процессом деградации метилацетата осуществляют с помощью газовой хроматографии на хроматографе "Pye

Unicam 104" по убыли метилацетата и образованию метанола. Колонка (70 см, Я2 мм)

5 заполнена Порапаком Q. Скорость Hz равна

30 мл/мин, воздуха — 300 мл/мин, Nz—

30 мл/мин. Температура колонки 110 С.

Ацетат определяют на газовом хроматографе "Хром 4". Колонка (1,8 м, 04 мм) заполнена Порапаком QS. Скорость Н2 рав на 35 мл/мин, воздуха — 300 мл/мин, й2—

35 мл/мин. Температура колонки 160 С.

К 15 ч культивирования разлагается

65$ метилацетата; метанол и ацетат в среде

5 отсутствуют, К 36 ч метилацетат и продукты его деградации (ацетат и метанол) в среде не обнаруживаются.

Экспериментальные данные представлены в таблице.

1687608

Вр т ку1

rus

24F

Составитель И. Болотина

Техред M.Moðråíòaë Корректор B. Гирняк

Редактор М, Петрова

Заказ 3678 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская нэб., 4/5

Производственно-издательский комбиНат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Как следует из данных таблицы, полученный консорциум микроорганизмов полностью разлагает метилацетат. Один из

ulTaMMoB консорциума (Pseudomonas зр.

RKM В-1735Д) способен полностью разла- 5 гать метилацетат при низких его концентрациях (0,1 — 0,5 г/л). При. более высоком содержании метилацетата в среде его деградация и рост штамма тормозятся накапливающимся токсичным метанолом. 10

Таким образом, консорциум бактерий Pseudomona; sp, ВКМ В-1735Д и

Methylobacillus methanolovorus ВКМ В1447Д обладает способностью полностью разлагать метилацетат при его концентрации до 5 г/л в течение 15 — 36 ч, что обеспечивает возможность его использования при очистке промышленных сточных вод ацетальдегидного производства.

Фо рмула изобретения

Консорциум штаммов бактерий

Pseudomonas sp. BKM В-1735Д и

Methylobaclllus methanolovorus ВКМ В1447Д, разлагающий метилацетат.