Штамм бактерий тнеrмus ruвеr-продуцент рестриктазы tru 9 1

 

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Цель изобретения - выявление штамма Thermus ruber - продуцента рестриктазы, являющейся изошизомером Mse I, обладающего более высоким выходом. Штамм Thermus ruber В КМ В-1730Д (9) получен в результате поиска продуцентов-рестриктаз среди термофильных бактерий горячих источников, хорошо растет на синтетической среде с сахарозой , мальтозой, рамнозой, галактозой, на натриевых солях уксусной, пировиноградной, яблочной, янтарной кислот, не восстанавливают нитраты до нитритов. Выход фермента 6000 ед/г биомассы, что в 3 раза больше известного, активность 12000 ед/мл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (st)s С 12 N 9/14, 1/20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4761890/13 (22) 11.10,89. (46) 30.10.91. Бюл. ¹ 40 (71) Научно-исследовательский и конструкто рско-технологический институт биологически активных веществ Научно-производственного объединения "Вектор" и

Институт микробиологии АН СССР (72) И.А.Цаплина, Т.И.Богданова, Г,И.Каравайко, Н,И.Речкунова; С,Х.Дегтярев и Е,А.Приходько (53) 571.18 (088.8) (56) Sato S., Hutchison С., Harris Ы. А thermostable sequence — specific endonuclease from

thermus aquaticus. — Proc. Notl Acad. Sci. USA, 1977, v, 74, №2 р. 542 — 546.

Morgan R.D. Msel, a unique restriction

endonuclease from Micrococcus species

which recognises 5 ТТАА 3 . — Nucl, Acads.

Res., 1988, ч. 16, ¹ 7, р, 3104.

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, в частности к получению эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять нуклеотидную последовательность 5 ТТАА 3 .

Цель изобретения — выявление штамма

Thermus ruber — продуцента рестриктазы, являющейся изошизомером Мэе!, обладающего более высоким выходом.

Штамм Thermus ruber 9 выделен из горячих источников и депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ

АН СССР под номером В-1730 D.

Штамм обладает следующими свойствами,,, SU 1687614 А1 (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ THERMOS RUBER—

ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТА36! Tru 91 (57) Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Цель изобретения — выявление штамма Thermus ruber— продуцента рестриктазы, являющейся изошизомером Mse 1, обладающего более высоким выходом, Штамм Thermus ruber

ВКМ В-1730Д (9) получен в результате поиска продуцентов-рестриктаз среди термофильных бактерий горячих источников, хорошо растет на синтетической среде с сахарозой, мальтозой, рамнозой, галактозой, на натриевых солях уксусной, пировиноградной, яблочной, янтарной кислот, не восстанавливают нитраты до нитритов.

Выход фермента 6000 ед/г биомассы, что в 3 раза больше известного, активность

12000 ед/мл.

Морфолого-культуральные признаки. ©О

Палочки диаметром 0,5 — 0,75 мкм, длиной 4

3 — 6 мкм или нитевидные клетки длиной 15 — 0

40 мкм. Бактерии грамотрицательные, неподвижные, жгутики и споры отсутствуют, ф, Колонии на картофельно-пептонном агоре ярко-оранжевого цвета, круглые, еле-- )» стящие, гладкие с ровным краем. В жидкой картофельной среде в пробирках рост в ви.й де мути у поверхности среды.

Физиологические признаки. Строгий аэроб, оптимум роста 60 С, рН оптимум 7 8

8,2. Хороший рост наблюдают на картофельной среде (20 ) с 0,5 $ пептона и 0,027, дрожжевого экстракта. Время генерации

60 мин.

1687614

Бактерии хорошо растут на синтетической среде с сахарозой, мальтозой, рамнозой, галактозой, хуже растут на среде с маннитом и глицерином, Хороший рост отмечен на натриевых солях уксусной, пировиноградной, яблочной, янтарной и фумаровой кислот. Слабый рост íà L-фруктозе, ксилозе, L-арабинозе, раффинозе. Нет роста на среде с инулином„сорбозой, декстрином и лимоннокислым натрием. На среце с

0,25% глюкозы обнаружен рост, при концентрации глюкозы 0,5% рост бактерий ингибировался.

Нет роста на среде с аланином, глицином, аспарагином, нитратом, сульфатом аммония и мочевиной. Растет на среде с гистидином, аспарагиновой кислотой, хуже с метионином и орнитином. На синтетической среде с лактоэой хорошим источником азота является пептон..

Бактерии не восстанавл .вают нитраты до нитритов, крахмал и казеин не гидролизуют, молоко, разбавленное в 5 раэ, свертывают и пептонизируют, гидролизуют желатин в концентрации 10 и 50%, сероводород, индол и ацетоин не образуют, серу и тиосульфат не окисляют. Бактерии чувствительны к NaCI в среде (1% NaCI в среде ингибирует рост бактерий), образуют каталаэу, антибиотики не образуют. Культура способна растворять клеточные стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий. Минимальная температура роста на агариэованной картофельной среде 40 С, оптимальная 60 С, максимальная 70 С.

Культуру хранят в лиофильно высушенном состоянии, Для культивирования T,ruber 9 применяют питательную среду следующего состава, %:

Картофельный отвар 20

Пептон 0,5

Дрожжевой экстракт 0,02 рН 7,8 — 8,2, Культивирование проводят при 60 C B течение 14 ч.

Выход биомассы 1 г/л культуральной жидкости.

Выход рестриктазь Tru 91 6000 ед/г биомассы.

Пример. Культивирование штамма, получение биомассы.

Клетки Thermus гыбег высевают на твердую среду, содержащую 20%-ный картофельный отвар, 0,5%-ный пептон и

0,02%-ный дрожжевой экстракт, инкубируют в течение 1 сут при 60"С, затем вносят петлей в 100 мл жидкой сред. ого же состао ва и подращивают B течение « 1 ч при 60 С, Полученный инокиня >носчт в 2 л среды и

Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой

Trv 91.

Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой

Trv 91, проводят сравнение экспериментально полученных длин фрагментов при гидролиэе ДНК фага il u pBR 322 с расчетными длинами фрагментов для различныхх нуклеотидн ых последовательностей.

Проведенный анализ показал, что существует единственная последовательность, для которой расчетные длины фрагментов совпавыращивают при 60 С. в течение 14 ч. После охлаждения клетки собирают центрифугированием, Выход биомассы 1 г сырой массы с 1 л среды.

5 Получение рестриктазы Tru 91.

2 г клеток суспендируют в 20 мл 0,02 М буфера трис-HCI, рН 7,5, содержащего

10 M /3-меркаптоэтанола и 0,1 тритона

Х-100, и разрушают на ультразвуковом дез10 интеграторе. Обломки клеток удаляют цент.рифугированием, надосадочную жидкость наносят на 20 мл фосфоцеллюлозы P — 11 (Whatman), уравновешенной. буфером А (0,02 М К-фосфат, РН 7,5, 0,001 М р -мер-.

15 каптоэтанол, 5 ° 10 М ЭДТА), Затем колонку промывают буфером А до исчезновения

УФ-поглощающего материала в элюате, Адсорбированный материал элюируют 240 мл градиентом 0-1,0 М NaCI в буфере А. Объем

20 каждой фракции 8 мл. Аликвоты из каждой фракции (мкл) инкубируют 1 ч при 60 С с 1 мкг ДНК фага Ли анализируют в геле агарозы. Фракции, расщепляющие ДНК фага Л (24 — 28), объединяют, диализуют 4 ч против

25 2 л буфера А и наносят на колонку с 10 мл бенэил-ДЕАЕ-целлюлозы (Segma).

Фермент элюируют 120 мл градиентом

0-1,0 M NaCI в буфере А. Объем фракций 4 мл. Фракции 6 — 8, содержащие рестриктаз30 ную активность, объединяют, диалиэуют 2 ч против 2 л буфера А и наносят на колонку с

5 мл гепарин-сефарозы (Pharmac)a). Элюцию ведут линейным градиентом NaCI 0 — 1,0

М в буфере А объемом 60 мл. Объем фракций

35 2 мл. Фракции 13-14, содержащие Tru 91, объединяют и диализуют против буфера А с

50%-ным глицерином. Полученный препарат фермента (1 мл) имеет активность 12000 ед/мл.

40 За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага Л в течение 1 ч при 60 С, Ферментный препарат хранят при — 20 С.

Выход фермента 6000 ед/г биомассы.

1687614 работах. Выход Tru 91 в 3 раза превышает выход известного соответствующего фермента, Формула изобретения

5 Штамм бактерий Thermus ruber BKM . В-1730 0 продуцент рестриктазы Tru 91.

3 дают с экспериментально полученными для

Tru 91, а именно последовательность ТТАА.

Таким образом, фермент Tru 91 является изошизомером Mse I и может быть использован вместо него во всех генно-инженерных

Составитель И. Привалова

Техред М.Моргентал Корректор T. Палий

Редактор М. Петрова

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 3678 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5