Способ определения активности антителообразующих клеток

 

Изобретение относится к иммунологии и может найти применение в клинической практике для оценки состояния гуморального иммунитета и в биотехнологии. Целью изобретения является повышение точности способа за счет определения количества и аффинитета антител, синтезируемых отдельной клеткой. Цель достигается тем, что анализируемую клеточную суспензию культивируют на нитроцеллюлозной мембране с иммобилизованным на ней антигеном , участки со связанными антителами выявляют, инкубируя мембрану с антииммуноглобулиновым конъюгатом и окрашивая n-фенилендиамином в буфере с рН 6,2 - 6,3 Мембрану денситометрируют, определяя для каждого пятна на ней максимальную оптическую плотность и диаметр на полувысоте пика оптической плотности, по этим данным определяют аффинитет антител и продуктивность каждой антителообралующей клетки, что в совокупности с количеством проявившихся пятен полностью характеризует активность популяции антителообразующих клеток 2 табл сл с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N 33/535

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4670592/14 (22) 12.04.89 (46) 15.11.91. Бюл, М 42 (71) Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины АМН СССР (72) А.И.Духин, Б.Л.Войцеховский и И.И.Агафонова (53) 615.373 (088.8) (56) l.immunol, Methods, 1985, v.79, Q 2, р.195 — 204. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АНТИТЕЛООБРАЗУЮЩИХ КЛЕТОК (57) Изобретение относится к иммунологии и может найти применение в клинической практике для оценки состояния гуморального иммунитета и в биотехнологии, Целью изобретения является повышение точности способа за счет определения количества и афИзобретение относится к иммунологии и может найти применение в клинической практике для оценки состояния гуморального иммунитета и в биотехнологии, Целью изобретения является повышение точности способа за счет определения количества и аффинитета антител, продуцируемых отдельной антителообразующей клеткой суспенэии.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе, включающем иммобилиэацию антигена на нитроцеллюлозной мембране, культивирование на ней анализируемой клеточной суспензии, с последующим удалением клеток и выявлением пятен иммунных комплексов иммунопероксидазным методом. согласно изобретению в качестве субстрата в иммунопероксидазном. Ж 1691753 Al финитета антител, синтеэируемых отдельной клеткой. Цель достигается тем, что анализируемую клеточную суспензию культивируют на нитроцеллюлозной мембране с иммобилизованным на ней антигеном, участки со связанными антителами выявляют, инкубируя мембрану с антииммуноглобулиновым коньюгатом и окрашивая и-фенилендиамином в буфере с рН 6,2 — 6,3, Мембрану денситометрируют, определяя для каждого пятна на ней максимальную оптическую плотность и диаметр на полувысоте пика оптической плотности, по этим данным определяют аффинитет антител и продуктивность каждой антителообразующей клетки, что в совокупности с количеством проявившихся пятен полностью характеризует активность популяции антителообразующих клеток, 2 табл.

° ваай методе используют и-фенилендиамин в бу- Оь фере с рН 6,2 — 6,3, нитроцеллюлозную мем- ь, ) брану денситометрируют, анализируют форму пика оптической плотности каждого пятна на ней, используя характеристики пика оптической плотности, численно решают уравнение диффузии антител по иммобилизованному антигену, и определяют.аффинитет и количество антител, продуцируемых каждой антителообразующей клеткой эа ъ время эксперимента. Сумма продуктивностей всех антителобразующих клеток в совокупности с их количеством, полностью характеризует активность антителообразующих клеток в анализируемой клето ной суспенэии.

Использование в качестве субстра1а ифенилендиамина в буфере с рН 6,2 — 6,3

1691753 позволяет добиться максимальной чувствительности при выполнении иммунопероксидаэного метода, Выбор субстрата и условий был осуществлен в предварительных экспериментах с иммобилизованной на нитроцеллюлозной мембране пероксидаэой хрена, Максимальная интенсивность окраски была получена при использовании и-фенилдиамина в буфере с рН 6,2 — 6,3 (табл.1). Высокая чувствительность иммунопероксидаэного метода позволяет сократить время всего способа, тем самым снизить ошибку неоднородности продукции антител, а интенсивная окраска пятен дает возможность провести детальное сканирование каждого пятна. Анализируя форму пика оптической плотности пятна, удается рассчитать с помощью предложенных формул, аффинитет и количество антител продуцируемых каждой клеткой за единицу времени. Тем самым охарактеризовать активность антителообразующих клеток в исследуемой клеточной суспензии двумя параметрами; количеством антителообразующих клеток в расчете на общее количество клеток и суммарной их продуктивностью, вычисленной с учетом аффинитета антител продуцируемых каждой отдельной антителообразующей клеткой, Таким образом, становится возможным в одном эксперименте полностью и точно охарактеризовать активность антителообраэующих клеток, Сущность способа заключается в следующем.

Нитроцеллюлозную мембрану с сорбированным на ней антигеном, помещают на . дно сосуда для культивирования клеток, куда затем вносят анализируемую клеточную суспензию в среде культивирования. После инкубации в атмосфере 5% углекислого газа при 37 С в течение 3 ч, мембрану промывают и переносят в раствор антииммуноглобулинового коньюгата на 16 — 20 ч.

Затем тщательно отмывают и инкубируют с раствором пренилендиамина в буфере с рН

6,2 — 6,3 в течение 5 — 10 мин. Реакцию останавливают, перенося мембрану в дистиллированную воду. Высушенную мембрану денситометрируют, определяя для каждого проявившегося пятна максимальную оптическую плотность (пятно учитывают если его максимальная оптическая плотность не меньше 0,05) и диаметр на полувь!соте пика оптической плотности, Эти данные используют для численного решения системы уравнений, полученных из теоретических представлений о диффузии антител из точечного источника по антигену иммобилизованному на пористом носителе

У

1 — е

44t

2 j о г

У

1 — е

A4t о(У) У

Л4 г о (v) С1у где у — параметр интегрирования;

10(у) — функция Бесселя;

20 S — концентрация связанных антител в центре пятна;

Л- коэффициент диффузии;

К вЂ” константа связывания в реакции антиген-антитело;

Н вЂ” концентрация иммобилизованного антигена;

Q — продуктивность клетки, t — время опыта;

Dl — шаг сканирования;

30 Dz — диаметр пятна на полувысоте оптической плотности, Решая систему уравнений, определяют

КН0 — величину, характеризующую аффинитет, и Q — продуктивность, антителооб35 разующей клетки (количество, r) иммуиоглобулинов, секретированное клеткой вединицу времени (с),,Для этого оценивают недостающие параметры; коэффициент диффузии — в случае иммуног40 лобулине G Л= 0,0 10 (c/cò), время ломте

t=10800 с(3 ч}; 01=8 10 см; Dz — определяется в эксперименте; So — величина, пропорциональная максимальной оптической плотности пятна, определяемой в экспери45 менте. Подставляя эти данные в уравнении, их решают численно, Программа реализуется на ЭВМ типа ДВК вЂ” 3 или! ВМ

РС. В результате для каждой антителообразующей клетки, оставившей на мембране

"след" в виде окрашенного пятна, получают величину, характеризующую ее продуктивность, с учетом аффинности секретируемых антител. Сумма продуктивностей каждой антителообраэующей клетки и их общее количество в анализируемой клеточной суспензии полностью характеризуют активность антителообразующих клеток, Пример 1. Предварительно готовят диски нитроцеллюлозных мембран по раз1691753

55 меру дна сосуда для культивирования клеток. Эти диски помещают на 2 — 3 ч в раствор антигена — очищенного вируса гриппа

А/PR/8/34 (0,5 мгlмл вирусного белка в

0 1 М фосфатном буферном растворе рН

7,4). После чего диски тщательно отмывают в фосфатном буферном растворе 3 раза и 2 раза в среде культивирования (199 среда, содержащая 10 эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота). Влажные диски размещают на дно 6-луночного планшета для культивирования клеток, Отдельно готовят суспензию клеток из селезенки инфицированных вирусом гриппа А/PR/8/34 мышей на 10 сутки инфекции. Суспензия содержит 10 клеток в 3 мл среды культивирования. В лунки планшета переносят по 3 мл суспензии. После чего планшет помещают СО2-инкубатор (5 CQz; 37 С) на 3 ч. По окончании инкубации нитроцеллюлозные диски извлекают, маркируют и отмывают от осевших на них клеток в холодном физиологическом растворе, содержащем 10 мМ ЭДТА, Далее диски отмывают 4 раза в буфере с молоком (2 ч обезжиренного молока+ 1 ч забуференного фосфатами фиэраствор4 и помещают на ночь и ри 4 С в раствор антииммунаглобулинового коньюгата (антитела против lgG мыши, меченные пероксидазой хрена в буфере с молоком) в рабочем разведении. Непрореагировавший коньюгат отмывают 4 раза буфером с молоком и 2 раза физраствором.

Нитроцеллюлозные диски подсушивают и помещают в раствор субстрата (1 мгlмл ифенилендиамина в 0,1 М фосфатцитратном буфере р Н 6,25) на 7 мин. Реакцию останавливают, перенося диски в дистиллированную воду на 30 мин, после чего их высушивают и денситометрируют на лазерном денситометре Ультрасан (LKB. Швеция) с шагом 80 мкм, принимая эа пятно превышение оптической плотности над фоном на

0,05 ОЕ. Определяют максимум оптической плотности для каждого пятна, диаметр пятна на полувысоте пика оптической плотности и общее количество пятен на единицу площади фильтра, Сканирование и обсчет проводят с помощью разработанного пакета программ. Полученные для каждого пятна характеристики подставляют в систему уравнений(1), которую решают численно, на

Э ВМ IBM PC, определяя аффинитет антител и их количество, секретируемых каждой клеткой за единицу времени. Из расчетных данных, полученных в результате сканирования участка нитроцеллюлазной мембраны (4 см ), формируют таблицу (см.табл.2). В этой таблице каждой антителообразующей клетке, оставившей "след" на мембране, соответствует свой номер, значение lnKH— характеризует аффинитет синтезируемых клеткой антител, Q — продуктивность каждой клетки (количество секретированных иммуноглобулинов в единицу времени). . 0 — суммарная продуктивность праанализираванных антителаабразующих клеток, Сумма продуктивностей антителообраэующих клеток и их общее количества полностью характеризуют активность антителообразующих клеток в анализируемой клеточной суспензии (см.табл.1 и 2}.

Предлагаемый cnocob, по сравнению с известным, имеет ряд преимуществ.

Способ позволяет анализировать аффинитет антител секретируемых отдельной антителаобраэующей клеткой, и на основе этого определять истинное количество антител секретируемых каждой клеткой, Характеризовать активность антителообразующих клеток по двум параметрам: количеству клеток и их продуктивности.

Способ разработан в лаборатории молекулярной биологии вирусов отдела молекулярной биологии НИИЭМ AMH СССР.

Формула изобретения

Способ определения активности антителоабразующих клегок путем иммобилизации антигена на нитроцеллюлознай мембране, культивирования на ней анализируемой суспенэии клеток с последующим удалением клеток и определением активности антителоабразующих клеток по анализу пятен иммунных комплексов иммунопероксидазным методом окраски, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения точности способа за счет определения количества и аффинитета антител, продуцируемых отдельной антителаобраэующей клеткой суспенэии, в иммунопероксидаэном методе окраски иммунных комплексов в качестве субстрата используют. FE-ôåíèлендиамин в буферном растворе с рН 6,2—

6,3, а пятно окраски антител от отдельной клетки денситометрируют и определяют максимальную оптическую плотность пятна и его диаметр на полувысоте пика оптической плотности с последующим вычислением по программе на ЭВМ количества и аффинитета антител отдельной клетки, 1691753

Таблица1

Таблица2

Суммарная продуктивность,, >, Q = 25,6.

Составитель П.Бонарцев

Редактор В,Трубченко Техред M,Mîðãåíòàë Корректор И.Муска

Заказ 3924 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент". r. Ужгород, ул.Гагарина, 101