Способ проведения точечного иммуноферментного анализа

 

Изобретение относится к методам исследования , применяемым в биологии и медицине , в частности к проведению точечного иммуноферментного анализа (ТИФА ). Цель изобретения состоит в ускорении и упрощении ТИФА. Сущность изобретения состоит в том, что твердофазный реагент в виде антител или антигена наносят на блок полимерной мембраны в виде параллельных полос, после чего мембрану либо разрезают на полосы перпендикулярно направлению нанесения реагента и обрабатывают определяемыми образцами и иммунореагентами в лотках или пробирках, либо разворачивают ее на 90° и обработку определяемыми образцами и иммунореагентами проводят в камере миниблоттера. Изобретение позволяет снизить затраты времени при нанесении твердофазного реагента в 3 раза, при добавлении тестируемых образцов и иммунореагентов в 2 раза, а также позволяет снизить расход реактивов в 15 раз по сравнению с прототипом. 2 табл

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

PF„CllYBJIVIK (я>ю G 01 N 33/535

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР,ч

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4725916/14 (22) 31.07.89 (46) 15.11,91. 6юл, N 42 (71) МГУ им. M.В,Ломоносова (72) Г.С.Власов, В.Е, Судовцев, И.6,Шепелева и Л.И.Краснопрошина (53) 612.015(088.8) (56) Hawkes R et а! Analijt, Biochem, 1982, ч,109, М 1, р,142 — 147, (54) СПОСО6 ПРОВЕДЕНИЯ ТОЧЕЧНОГО

ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА (57) Изобретение относится к методам исследования, применяемым в биологии и медицине, в частности к проведению точечного иммуноферментного анализа (ТИФА). Цель изобретения состоит в ускорении и упрощении ТИФА. Сущность изобретения

Изобретение относится к методам исследования, применяемым в биологии и медицине, в частности к проведению точечного иммуноферментного анализа, Целью изобретения является ускорение и упрощение способа проведения точечного иммуноферментного анализа (ТИФА).

Способ осуществляется следующим образом.

Вырезают иэ листа микропористой мембраны (нитроцеллюлоэа. поливинилендихлорид, полиамиды и др.) блок таких размеров, чтобы можно было нанести заданное количество антигенов (или антител) в виде полосок шириной 1 — 5 мм с расстояниями между ними не менее 2 мм. Мембранный блок можно предварительно модифицировать любым из способов для усиления сорбционной активности или активировать для ковалентного связывания твердофазного

„„5LI „„1691754 А1 состоит в том, что твердофаэный реагент в виде антител или антигена наносят на блок полимерной мембраны в виде параллельных полос, после чего мембрану либо разрезают на полосы перпендикулярно направлению нанесения реагента и обрабатывают определяемыми образцами и иммунореагентами в лотках или пробирках, либо разворачивают ее на 90 и обработку определяемыми образцами и иммунореагентами проводят в камере миниблоттера. Изобретение позволяет снизить затраты времени при нанесении твердофазного реагента в 3 раза, при добавлении тестируемых образцов и иммунореагентов в 2 раза, а также позволяет снизить расход реактивов в 15 раз по сравнению с прототипом. 2 табл. реагента. Выбранные для скрининга антигены (или антитела) наносят на подготовленный блок одним. из существующих методов, например, с помощью аппарата для аппликации образцов в тонкослойной хроматографии. с помощью автоматической пипетки или аппарата для мультиблоттинга таким образом, чтобы получились тонкие параллельные полоски по всей длине блока.

Существенно, чтобы каждый антиген (или антитело) локализовались только в своей полосе и не смешивались. Предварительно, опытным путем, определяют оптимальное количество твердофазного реагента на единицу площади полости. Отмывают несвязавшиеся компоненты буферным раствором (например, 20 мМ трис-H CI, 500 мМ ИаС!, рН

7,4, содержащим 0.05 — 0,17; неионного детергента типа тритон Х-100 или нонидет P40) и блокируют свободные центры

1691754 связывания мембраны индифферентным белком (1 — 3 бычий сывороточный альбумин, 1 — З желатин, 1 — З казеин, 5 обезжиренное молоко и др). При выявлении антител к большому количеству антигенов (до 20 и более) способ можно проводить. в нескольких вариантах.

".. Блок мембраны с нанесенными в виде узких полос антигенами (или аллергенами) разрезают на тонкие (2 — 3 мм) полоски перпендикулярно направлению нанесения, В этом случае на каждой полоске эоны с нанесенными антигенами чередуются со свободными зонами. Инкубация с анализируемым образцом и последующее проявление иммунных комплексов осуществляется отдельно в лотках для каждой пробы.

2. Блок мембраны с иммобилиэованными в виде узких тонких полос антигенами вначале наклеивают на пластмассовую пластинку (например, из поливинилхлорида), а затем нарезают полоски мембраны аналогично первому варианту, Последующая инкубация таких индикаторных полосок с тестируемым образцом и иммунореагентами осуществляется в узких пробирках.

3, Блок мембраны с иммобилизованными в виде узких тонких полос антигенами помещают в аппарат для мультиблоттинга, при этом разворачивают мембрану на 90 по отношению к направлению инкубационных каналов. Тестируемые образцы наслаивают на мембрану в виде тонких параллельных узких полос шириной 1 — 5 мм и расстояниями между ними не менее 2 мм.

Это приводит к образованию в участках перекреста со специфическим антигеном иммунных комплексов. Последующее выявление иммунных комплексов осуществляется во всех трех вариантах по единой схеме; отмывка от несвязавшихся компонентов, добавление антивидовых антител. меченных ферментом, повторная отмывка несвязавшихся компонентов и выявление активности фермента с помощь«о субстратхромогенной смеси, Пример 1, Определяют Ig Е-антитела к девяти аллергенам, имеющих ведущее значение в клинике аллергических заболеваний. Параллель",î проводят анализ аллергенспецифических Ig Е-антител по способу прототипа M с помощью радиоаллергосорбентного метода (коммерческие наборы

"Фадебак PACT" "PharlnacIa", Швеция.

1, Из нитроцеллюлозной мембраны выреза«от блок размером 7,4х7,4 см и промывают дистиллированной водой 3 раза по 10 мин.

2, Препараты аллергенов (экстракты по

60 мкг белка в мл) наносят с помощью автоматического дозатора для тонкослойной хроматографии ДТХ-01 в виде тонких узких параллельных полос в следующей последовательности; 1 — домашней пыли, 2 — клеща домашней пыли Дер. птеронис, 3 — шерсти собак, 4 — шерсти кошек, 5 — гриб Альтернар

6 — пыльцы березы, 7 — пыль«ць«амброзии, 8— пыльцы тимофеевки 9 — пыльцы тополя, 10— референс-препарат аллергенов трески, охарактеризованный по компонентному соста10 ву в иммуноблоттинге. Затем оставляют полоску свободной мембраны шириной 6 мм и повторно наносят экстракты препаратов аллергенов в той же последователь15

55 ности. Таким образом на одном листе мембраны получают два мембранных блока с иммобилизованными в виде тонких узких параллельных полос девятью препаратами аллергенов и одним референс-препаратом, 3, Блок промывают солевым Трис-HCI буфером (20 мМ трис-HCI, рН 7,4,500 мМ

NaCI, 0,05 твин-20) по 2 мин 5 раз.

4. Блокируют свободные центры связывания бычьим сывороточным альбумином (3 БСА в вышеприведенном трис-HCI буфере-ТБС) в лотке при комнатной температуре в течение 60 мин.

5. Блок разрезают на две равные части, приклеивают каждую к пластинке поливинилхлорида и разрезают на полоски шириной 3 мм. Таким образом, из одного блока размером 7,4х4 см получают 48 мембран ных полос, содержащих в каждой по 9 зон с препаратами аллергенов и одну зону с референс-и репаратом (всего 480 проб).

6, Сыворотку крови больных разводят в соотношении 1:10 ТБС, содержащим 1

БСА и 0,05 твин-20, разливают в узкие пробирки по 1 мл и опускают в каждую полоски таким образом, чтобы они полностью смачивались сывороткой, В отдельную пробирку заливают референс-сыворотку в разведении 1:10, содержащую уровень

IgE-антител к треске, соответствующий Il классу по PACT (полоска сравнения). Все образцы ин кубируют в течение 12 ч при комнатной температуре.

7. Индикаторные полоски отмывают 5 раз по 2 мин буфером ТБС, содержащим

0,05 твин-20.

8, Образовавшиеся иммунные комплексы выявляют конъюгатом пероксидазы с моноклональными антителами против IgE человека. В пробирку с полосками добавляют 1 мл рабочего разведения коньюгата (1:1000) и выдерживают при комнатной температуре 1 ч, 9. Несвязавшиеся компоненты отмывают тем же буфером два раза по две мин.

10. Проявление в субстрат-хромогенной смеси проводят следующим образом. Перед

1691754 началом реакции смешивают свежеприготовленные растворы субстрата (6 мкл 30 перекиси водорода в 10 мл ТБС) и хромогена (6 мг 4-хлор-1-нафтола в 2 мл метанола).

Полоски выдерживают в этой смеси 15 мин, Реакцию останавливают промыванием полосок дистиллированной водой.

11. Результаты реакции учитывают визуально путем сравнения интенсивности окраски зон индикаторных полосок с интенсивностью окраски зоны на референс-и репарате. Содержание аллергенспецифических Ig E-антител выражают в трех уровнях: II класса, II класс. < II и класса. Отрицательным контролем реакции служили зоны мембраны, не содержащие аллергенов, Для скрининга аллергенспецифических ig E-антител такая полуколичественная оценка вполне достаточна для диагностики аллергических заболеваний, Если необходимо, результаты реакции оценивают количественно в единицах оптической плотности при помощи денситометрии.

Специфичность и чувствительность заявляемого способа оценивают по корреляции с данными PACT при тестировании 121 сыворотки, полученных от пациентов с клинически подтвержденным диагнозом. Результаты исследований представлены в табл.1.

Пример 2, 1, Из листа нитроцеллюлозной мембраны вырезают блок размером

7,4х7,4 см и промывают его дистиллированной водой 3 раза по 5 мин, 2. После подсушивания блока наносят с помощью автоматического дозатора для тонкослойнай хроматографии ДТХ-01 препаратов экстрактов (60 мг белка с мл) в виде тонких узких параллельных полос в следующей последовательности: 1 — домашней пыли (смесь трех серий),2 — библиотечной пыли, 3 — пыли меховых изделий; 4 — шерсти овец, 5 — шерсти кошек, 6 шерсти собак, 7— пера подушек, 8 — клеща домашней пыли (Дер, птеронис), 9 — клеща домашней пыли (Дер. фарина), 10 — клеща домашней пыли (акарус зиро), 11 — гриба Аспергилус флав, 12 — гриба Кладоспориум, 13 — гриба Альтернариум, 14 — гриба Эроглюфус, 15 — пыльцы березы, 16 — пыльцы амброзии, 17 — пыльцы тимофеевки, 18 — пыльцы тополя, 19 — пыльцы одуванчика; 20 — пыльцы клена, 21 — пыльцы овсянницы, 3. Мембранный блок промывают ТБС, как в примере 1.

4. Блокируют свободные центры связы вания мембраны как в примере 1.

5. Инкубацию твердофазного носителя с сывороткой крови больного проводят в

55 камере миниблоттера ("ImmUneties", США}.

Для этого перед установкой мембранного блока в аппарат его разворачивают на 90О, Следовательно. направление инкубационных каналов камеры становится перпендикулярным направлению полос сорбированных аллергенов. В каждый канал вносят 100 мкл разведенной (1:2) сыворотки крови, Камеру покачивают на платформе с частотой 58 качаний в 1 мин при комнатной температуре в течение 2 ч, 6. Промывают камеру и мембрану, прокачивая через каналы ТБС.

7, Добавляют в каждый канал камеры по

100 мкл коньюгата пероксидазы с моноклональными антителами против IgE человека и покачивают камеру на платформе с частотой 58 качаний в 1 мин при комнатной температуре в течение 60 мин.

8. Промывают камеру и мембрану, прокачивая через каналы ТБС.

9. В каждый канал камеры вносят по

100 мкл субстрат-хромогенной смеси, содержащей 0,6 объемов, 0,3% 4-хлор-1-нафтола в метаноле и 10 объемов ТБС с 0,004 обьема 307ь перекиси водорода.

10. Платформу покачивают с ранее указанной частотой s течение 15 мин при комнатной температуре.

11. Промывают камеру и мембрану дистиллированной водой.

Проявление иммунных комплексов (стадия 9 — 11) может осуществляться и в лотках, однако в этом случае наблюдается значительный расход иммунореагентов.

Воспроизводимость, чувствительности и специфичность заявляемого способа и прототипа оценивали в комплексе с данными, полученными для PACT. Показана высокая степень совпадения случаев уровня аллергенспецифических Ig E-антител (табл,1). Сравнительный анализ отличий заявляемого способа и прототипа выявил существенные преимущества (табл,2), которые можно суммировать следующим образом; заявляемый способ существенно снижает затраты времени на проведение анализа (при нанесении твердофазного реагента в 3 раза, а при добавлении тестируемых образцов и иммунореагентов в 2 раза; упрощение способа выражается в значительном уменьшении расхода реактивов (в 15 раз1 по сравнению с прототипом.

Формула изобретения

Способ проведения точечного иммуноферментного анализа, включающий нанесение антигена или антител на полимерную

1691754 мембрану с последующим добавлением исследуемого образца, инкубацией и проявлением иммунных комплексов, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, антигены и антитела 5 наносят на блок полимерной мембраны в виде параллельных полос, далее либо мембрану разрезают на полосы перпендикулярно направлению нанесения материала и обрабатывают реагентами в лотках или пробирках, либо разворачивают ее на 90 и обработку, исследуемым образцом проводят в камере миниблоттера.

Таблица1

Определение уровней аллергенспецифических lgE-антител, выявленных заявляемым способом и методом PACT

Общее к-во сывороток, содержащих IgE антител

Число случаев совпадения уровня

Ig Е-антител

Процент совпадения случаев уровня (д Е-антител

Аллерген

Таблица2

Сравнительный анализ отличий заявляемого способа и прототипа по примеру 2

Значение показателей по способам

Показатель заявляемый и ототип

Коэффициент вариации результатов в одном опыте. 7;

Коэффицент вариации результатов между опытами %

Время нанесения твердофазного peareHTB при подготовке блока на 21 пробу с 21 препаратом аллергенов, мин

Время нанесения тестируемых образцов, мин

Время нанесения иммунореагентов,мин

Расход препарата аллергенов, мкл

Расход рабочего разведения конъюгата пероксидэзы с моноклональными igE-антителами человека,мл

Расхо с бст ат-к омогенной смеси,мл.

2,7

9,4

3,8

12,5

22

22

2,1

2,1

31,5

31,5

Составитель А.Скурат

Техред М.Моргентал Корректор И,Муска

Редактор В.Трубченко

Заказ 3924 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент". r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Домашняя пыль

Клещ дом. пыли

Шерсть собак

Шерсть кошек

Гриб Альтернариум

Пыльца березы

Пыльца амброзии

Пыльца тимофеевки

Пыль а тополя

18

11

16

14

7

9

13

12

83,3

90,9

80,0

70,0

80,0

90,0

81,2

85,7

90,0