Способ получения туляремийного антигена

 

Изобретение относится к медицине, а именно к получению диагностических препаратов . Цель изобретения-повышение антигенной активности и специфичности препарата. Способ включает выращивание вирулентного штамма туляремийного микроба на твердой питательной среде, экстрагирование антигена неионным детергентом Твин-80, отделение микробной массы центрифугированием и дополнительную очистку надосадочной жидкости ультрацентрифугированием с последующей гель-хроматографией раствора полученного осадка в 0,01 М аммоний-бикарбонатном буфере, содержащем додецилсульфат натрия, на колонке с сефакрилом S-300, диализом антиген содержащих фракций, осаждением продукта этанолом и лиофилизацией. (Л С о. о ю ел 00 о

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)л А 61 К 39/02

3Ж

М НП3БИБЛ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4676656/13 (22) 11,04.89 (46) 23,11.91. Бюл, ЬЬ 43 (71) И ркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока (72) Л.П.Шишкина, Е.Ю.Марков, Л.В.Меринова и Н.А.Суханов (53) 616-097(088.8) (56) 1. Олсуфьев Н,Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. — М,: Медицина, 1975, 2. Viljanen М.К., Nurml Т., Salmlnen А.

Enzyme-linked Immunosorbent assay (E LI SA)

with bacterial conjugat-antigen from IgM, IgA аnd IgG ам! Ьоdies tî Fr. tulаrensls:

comparison with bacterial agglutination test

and ELlSA with IlpopolIsaccharide antigen.—

J.infect. Dls. 1983. ч. 48, N 4, р. 715-720.

3. Bevanger 1.„Maetand I.À., Naess АЛ.

Agglutinlns and antibodies to Francisella

tularensls outer membrane antigens in the

early diagnosis of disense during an aetbreak

of tularemia. — J. СИп. Mlcroblol. 1988, ч. 26, N3,,р. 433-437. . 4. Garison Н.Е., Llndberg А.А., Lindberg G., Hedersteadt В., Karlsson К.А., Agell В.О.

Enzyme-linked immunosorbent assay for

Immunological diagnosis of human tularemia.—

А Clln. Mlcroblol, 1979, ч. 10, N 5, р. 615-621.

5. Сухарь В.В. Выделение А-антигена туляремийного микроба. — ЖМЭИ. 1973, N.

1, с. 41.

6. Сухарь В.В. Изучение антигенного состава некоторых штаммов туляремийного микроба. Сообщение 1. — ЖМЭИ, 1965, N. 1111, с. 38-43.

7. Брикман Д.И. О литическом действии дезоксихолата натрия на возбудитель туляремии. — ЖМЭИ, 1971, М 5, с. 141-143, / Ж„, 1692580 А1 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТУЛЯРЕМИИНОГО АНТИГЕНА (57) Изобретение относится к медицине, а именно к получению диагностических препаратов. Цель изобретения — повышение антигенной активности и специфичности препарата. Способ включает выращивание вирулентного штамма туляремийного микроба на твердой питательной среде, экстрагирование антигена неионным дегергентом

Твин-80, отделение микробной массы центрифугированием и дополнительную. очистку надосадочной жидкости ультрацентрифугированием с последующей гель-хроматографией раствора полученного осадка в 0,01 М аммоний-бикарбонатном буфере, содержащем додецилсульфат натрия, на колонке с сефакрилом S-300, диализом антиген содержащих фракций, осаждением продукта этанолом и лиофилизацией.

1692580

10

40

Изобретение относится к медицине, а именно к получению диагнЬстических препаратов, и может быть использовано для конструирования иммунохимических тестсистем для обнаружения специфических противотуляремийных антител и для постановки аллергической пробы, Известны способы приготовления антигенных препаратов из убитых формалином микробных клеток (1), из разрушенных ультразвуков микробных клеток (2) и из препаратов наружных мембран (3), Известны способы получения разной степени очистки препаратов специфических антигенов водно-фенол ьной (4), водноацетоновой (5), и солевой (6) экстракции, Недостатком укаэанных способов является использование токсических для человека веществ (фенола, эфира, ацетона), обработка которыми микробной массы может изменять нативные свойства и экстрагируемость бактериальных антигенов, Использование цельных микробных клеток или их фрагментов (наружные мембраны) или водно-солевых экстрактов в качестве специфического антигена нежелательно иэ-за возможности ложноположительных реакций, связанных с наличием неспецифических антигенов.

Известен способ получения туляремийного антигена (туля ринлизата), включающий получение микробной массы, обработку ее детергентом в течение 2 ч при

37 С для обеспечения лизиса и экстракции поверхностных антигенов туляремийного микроба с последующим прогреванием в течение 10 мин при 90 С для обеззараживания микробной массы и центрифугированием при 10000xg в течение 30 мин (7), Недостатком способа является низкая степень очистки препарата специфического антигена от детергента, балластных бактериальных антигенов и нековалентно-связанных липидов, не обеспечивается выход стандартизованного высокоактивного препарата.

Целью изобретения является повышение антигенной активности и специфичности препарата, В качестве исходного продукта для получения специфического белково-липополисахаридного антигена туляремийного микроба используют взвесь вирулентных клеток возбудителя туляремии штамма

Tr. tularensls 777. Культуру выращивают на желточном агаре Анциферова в течение 48 ч при 37"С. Затем после проверки на чистоту, путем микроскопирования, культуру смывают стерильнь м 0,9 j,— íûì раствором хлорида натри рН 7,2 и готовят микробную взвесь в концентрации 20 млрд микробных клеток по 0С0 мутности ГИСК имени

Л,А,Тарасевича. К полученной взвеси стерильно добавляют 1 твина-80 до конечной концентрации, выдерживают 2 ч при 37 С и прогревают 10 мин при 90 С на водяной бане при периодическом перемешивании, Полученную микробную массу проверяют на стерильность и при отсутствии специфического роста проводят центрифугирование при 10000xg в течение 30 мин для освобождения от неразрушенной микробной массы.

Супернатант, содержащий экстрагированные антигены туляремийного микроба, подвергают ультрацентрифугированию при

105000xg в течение 2 ч при 4 С для осаждения белково-липополисахаридного комплекса туляремийного микроба, освобождения от детергента и низкомолекулярных соединений, Образовавшийся осадок ресуспендируют в небольшом количестве дистиллированной воды. Затем проводят окончательную очистку препарата, предварительно растворенного в 0,01 М аммоний-бикарбонатном буфере рН 8,5 с добавлением 2ф, додецилсульфата натрия, для полного растворения антигенного осадка, гельфильтрацией на колонке с севакрилом S-ЗОО, уравновешенной 0,01 M аммоний-ацетатным буфером в присутствии

0,1 додецилсульфата натрия. Препарат элюируется этим же буфером под контролем проточного спектрофотометра и самописца и собирается в пробирки по 2 мл. Объединяют фракции, содержащие целевой продукт, диализуют в течение суток против проточной воды и осаждают антиген добавлением к раствору десяти объемов охлажденного до

4 С этанола, Выдерживают смесь в холодильнике в течение суток и центрифугируют в течение 40 мин при 6000xg, Осадок растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и лиофильно высушивают.

Полученный препарат является комплексным белково-липополисахаридным антигеном. В его состав входит около 7 (, белка, 20 эквивалентов глюкозы (реакция с фенолом и концентрированной серной кислотой), Препарат дает положительную качественную реакцию с суданом черным на наличие липидов, практически свободен от примесей нуклеиновых кислот, Препарат вызывает сдвиг максимума поглощения карбоцианинового красителя Stains all (Serva. ФРГ) (метахроматический эффект) в коротковолновую часть спектра (472 нм), что характерно для липополисахаридов грамотрицательных бактерий. Препарат иммунохимически идентичен ЛПС, выделенному воднО-фенольной экстракцией, что следует

1692580 из слияний полос преципитации антигена, полученного предлагаемым способом и известным (4).

По своей специфической активности в иммуноферментном анализе полученный очищенный препарат превосходит препарат, полученный по известному способу P) в 16-32 раза.

Эритроцитарный диагностикум, приготовленный сенсибилиэацией предлагаемого антигена, также пригоден для иммунохимических исследований. валентной дозы коммерческого тулярин-лизата — 7 мм).

Формула изобретения

5 Способ получения туляремийного антигена, включающий культивирование туляремийного микроба, отделение бактериальных клеток, обработку детергентом, стерилизацию прогреванием с последую10 щим низкоскоростным центрифугированием и выделением надосадочной жидкости, содержащей целевой продукт, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения антигенной активности и специфичности

15 препарата, проводят дополнительную очистку надосадочной жидкости ультрацентрифугированием при 105000xg в течение 2 ч, полученный осадок растворяют в 0,01 М аммоний-бикарбонатном буфере, содержа20 щем додецилсульфат натрия, затем очищают гельхроматографией на колонке с сефакрилом S-300, собирают фракции, содержащие антиГен, диализуют их, далее осаждают целевой продукт этанолом, отде25 ляют осадок центрифугированием, растворяют его в дистиллированной воде и лиофилизуют.

При изучении биологических свойств отмечено, что полученный белково-липополисахаридный антиген нетоксичен для белых мышей, стимулирует выработку антител у кроликов до титра 1:1000000 — 1:8000000, при иммунизации неочищенным туляринлизатом 1:6400 — 1:512000, при иммунизации водно-фенольным ЛПС вЂ” до титра

1:6400 в иммуноферментном анализе. Кроме того, препарат при изучении In vivo обладает аллергенными свойствами (накожная аллергическая реакция до 15 мм по сравнению с реакцией на введение эквиСоставитель Л,Шишкина

Техред М.Моргентал Корректор M.Äåì÷èê

Редактор Н.Гунько

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 4028 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5