Способ выделения липидов

 

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к способу получения липидов, стимулирующих биосинтез экзоферментов. Целью изобретения является упрощение процесса и улучшение свойств получаемого продукта. Предложен способ получения липидов из влажной биомассы микромицетов путем ее последовательной обработки 0,3- 3%-ным раствором уксусной кислоты и этанолом , содержащим 0,1-5% тринатрий фосфата. Полученную водно-липидную эмульсию экстрагируют гексаном или смесью гексан - вода. Выход липидов 6,4- 8,0% от сухой биомассы грибов. Полученные липиды используют как стимуляторы биосинтеза целлобиазы и пеногасители. 3 з.п. ф-лы, 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5!)5 С 12 Р 7/64

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Ы (21) 4726598/13 (22) 27.07.89 (46) 23.11.91. Бюл. N 43 (71) Институт микробиологии AH СССР и

Научно-производственное обьединение

"Биотехника" (72) Е. П, Феофилова, Б. А. Величко, Л, С.

Когтев, О. А. Лобачева и М. В. Волохова . (53) 577.115(088:8) (56) Kates M. Techniques of lipldology, Isolation, analysis and identification of lipids.

2 nd rev. edit. Elsevier, 1986. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ,ЛИПИДОВ (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения липидов, Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения липидов, стимулирующих биосинтез экзоферментов, из влажной биомассы микромицетов — основного отхода микробиологических произВодтсв, Целью изобретения является упрощение процесса и улучшение свойств получаемого продукта.

Для этого влажную биомассу (75-90$) мицелиальных грибов, например, рода

Asperglllus и представителей рода

Trichoderrna обрабатывают 0,3-3 -ным раствором уксусной кислоты при соотношении биомасса: раствор 1:2. Обработку проводят в.течение 10-75 мин при интенсивном перемешивании и температуре 10-45 С. Далее водную фазу декантируют. а биомассу дважды промывают водой с последующей декантацией водной фазы; к влажной биомассе добавляют этанол, содержащий 0,1-5 тринатрийфосфата; соотношение влажная био„„Я3 „„1693055 А1 стимулирующих биосинтез экзоферментов.

Целью изобретения является упрощение процесса и улучшение свойств получаемого продукта. Предложен способ получения липидов из влажной биомассы микромицетов путем ее последовательной обработки 0,33 (,-ным раствором уксусной кислоты и этанолом, содержащим 0,1-57(тринатрий фосфата. Полученную водно-липидную эмульсию экстрагируют гексаном или смесью гексан. — вора. Выход липидов 6,48,0";ь от сухой биомассы грибов. Полученные липиды используют как стимуляторы биосинтеза целлобиазы и пеногасители. 3 з,п. ф-лы, 3 табл. масса: экстрагент 1:3 (масса:масса), экстракцию проводят при интенсивном механическом перемешивании в течение 40-120 мин и температуре 20-45 С. Далее жидкую фазу Декантируют, а биомассу повторно экстрагируют при тех же условиях, что и для первой ступени экстракции. После декантации экстракты объединяют и концентрируют выпариванием на роторном испарителе до начала вспенивания остатка.

Регенерированный этанол составляет 70 от объема экстрагента и используется при дальнейшей экстракции.

К полученной после концентрирования водно-липидной эмульсии добавляют гексан или смесь гексан:вода в соотношении

3:1 (объем:объем) при соотношении эмульсия:смесь 1:3. Далее смесь интенсивно перемешивают в течение 5-45мин. После окончания перемешивания происходит расслоение жидкой фазы. Верхний слой (гексановая фракция) отбирают и сушат над

1693055

15

30

40

55 безводным сульфатом натрия в течение 1525 мин. После фильтрации через фильтр раствор концентрируют упариванием на роторном испарителе. Общий выход липидов составляет 6,4-8,0 от абсолютно сухой биомассы, Общее время, затраченное на выделение липидов, составляет 5-6 ч, Полученные липиды в концентрации 0,01-0,5 4 от объема питательной среды используют как добавки по двойному назначению. Вопервых, в качестве пеногасителя взамен дефицитных животных жиров (кашалотовый жир) или дорогостоящих синтетических пеногасителей (пропинол Б-400). Во-вторых, при добавлении липидов в питательную среду целлобиазная активность составляет

18,6-19,9 ед/мл, т.е, при значении активности 19, 8 ед/мл в 1,6 раза больше контрольных значений. Данные приведены в табл, 1.

Полученные по предлагаемому способу липиды обладают следующими характеристиками.

Внешний вид; подвижное, полупрозрачное масло темно-желтого цвета. Запах: напоминает эа пах зоастител ьн ого масла.

Плотность 0,98 г/см . Токсичность; не изучена. Пожаровзрывоопасность: безопасен, Количественный анализ нейтральных липидов в экстрактах, полученных по предлагаемому способу и методом Фолча. проводят методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) с последующей сканирующей денситометрией. ТСХ проводят на пластинках с силикагелем фирмы Мерк (ФРГ), Для разделения используют систему гександиэтиловый эфир: уксусная кислота (80;20;1).

Идентификацию зон на хроматограммах проводят, используя стандарты и литературные данные, Сканирующую денситометрию проводят на приборе фирмы "Камак" (Франция), Полученные денситограммы обсчитывают, используя метод вырезаниявзвешивания. Результаты количественного анализа представлены в табл. 2, Количественный анализ жирных кислот из липидов, полученных по предлагаемому и известному способам, проводили методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Условия проведения анализа: ГЖХ проводили на хроматографе "Хром-4" (ЧССР) на колонке,с 5 жидкой фазой Силар 5 ЦП. Параметры колонки 2500х3 мм.

Режим разделения — изометрический, Температуры: колонка 180 С, инжектор 210 С, детектор 250 С. Газ-носитель — азот, скорость газа 40 мл/мин. Детектирование — плазменно-ионизационное. Метиловые эфиры жирных кислот получают из суммарных липидов и использованием кислого метанолиза. при 80 С в течение 6 ч с последующей экстракцией гексаном. Идентификацию пиков на хроматограммах проводили, используя стандартные образцы метиловых эфиров жирных кислот от С 16:0 до С 20:О.

Количественный анализ проводили методом триангуляции с последующей статистической обработкой при и = 6.

Результаты количественного анализа жирных кислот в экстрактах, полученных по известному и предлагаемому способам, представлены в табл. 3.

Пример 1. 200 г влажной биомассы микромицета Aspergillus japonicus BKMF2632 обрабатывают 1,2 -ным водным раствором CHsC00H при соотношении биомассы:раствора 1:2 в течение 45 мин при интенсивном перемешивании и температуре 30 С. Далее водную фазу декантируют, а к биомассе добавляют этанол, содержащий

2,8 тринатрийфосфата (йазР04), Соотношение влажная биомасса:экстрагент 1:3 (масса;масса). Экстракцию проводят в течение 80 мин при механическом перемешивании и температуре 30 С. Далее жидкую фазу декантируют, а биомассу повторно экстрагируют тем же количеством экстрагента при идентичных условиях. После объединения экстрактов проводят их концентрирование выпариванием на роторном испарителе до получения устойчивой водно-липидной эмульсии.

К эмульсии добавляют смесь гексан:вода 3:1 (объем:объем) при соотношении эмульсия;смесь 1:3. Далее проводят перемешивание при 1000 об/мин в течение

30 мин. После окончания перемешивания и расслоения смеси верхнюю фазу отбирают.

Нижнюю фазу повторно обрабатывают смесью гексан:вода при тех же условиях, Объединенную верхнюю фазу сушат над безводным сульфатом натрия, затем фильтруют через вату и концентрируют выпариванием на роторном испарителе до постоянного веса твердого остатка. Полученные липиды представляют собой темно-желтое гомогенное о масло. Общий выход липидов 7,8 от веса абсолютно сухой биомассы.

Полученные липиды добавляют в питательную среду в концентрации 0,1 об. до стерилизации. В контрольном опыте продуцент целлобиазы (целлюлолитического экзофермента) выращивают на регламентной среде с добавлением липидов, полученных по известному способу. В другом контрольном опыте в питательную среду липиды не вносят. Культивирование микромицета, А.

japonicus проводят на круговой качалке при

200+20 об/мин и 28 С в колбах емкостью 0,7 л с загрузкой по 100 мл питательной среды.

Стерилизацию среды проводят при 1 атм в

1693055 течение 0,5 ч при ZQ С, Культивирование микромицета осуществляют в течение 7 сут, далее культуральную жидкость отделяют центрифугированием при 6000 06/мин и исследуют на активность целлобиазы, 5

При добавлении липидов, полученных предлагаемым способом, целлобиаэная активность увеличивается в 1,6 раза по сравнению с контролем (внесение липидов, полученных по известному способу)-и со- 10 ставляет 19,8 ед/мл.

Пример 2. Осуществляют процесс согласно примеру 1, но влажную биомассу обрабатывают 0,5 -ным раствором уксусной кислоты при времени обработки 10 мин, 15

Выход липидов 6,7, активность целлобиазы 19,0 ед/мл.

Пример 3. Осуществляют процесс согласно примеру 1, но влажную биомассу обрабатывают 2,7%-ным раствором уксус- 20 ной кислоты при времени обработки 75 мин.

Выход липидов 6,6, активность целлобиазы 18,9 ед/мл.

Пример 4. Осуществляют процесс согласно примеру 1, но влажную биомассу 25 обрабатывают 0,3%-ным раствором уксусной кислоты при 10 С. Выход липидов 6,9%, активность целлобиазы 18,8 ед/мл.

Пример 5. Осуществляют процесс согласно примеру 1, но влажную биомассу 30 обрабатывают 3%-ной уксусной кислотой при 45 С. Выход липидов 6.8%, активность целлобиазы 18,9 ед/мл, fl р и м е р 6. Осуществляют процесс согласно примеру 1, но экстракцию прово- 35 дят в течение 40 мин этанолом, содержащим

0,1% тринатрийфосфата. Выход липидов

6,7, активность целлобиазы 19,0 ед/мл.

Пример 7. Осуществляют процесс согласно примеру 1, но экстракцию прово- 40 дят этанолом, содержащим 5 тринатрийфосфата, в течение 120 мин. Выход липидов

6,6%, активность целлобиазы 18,6 ед/мл.

Пример 8. Осуществляют процесс согласно примеру 1, но водно-липидную 45 эмульсию экстрагируют смесь гексан:вода в течение 45 мин. Выход липидов 6,7%, а активность целлобиазы 18,8 ед/мл.

Пример 9. Осуществляют процесс согласно примеру 1, но экстракцию водно- 50 липидной эмульсии гексаном проводят 5 мин. Выход липидов 6,5, активность целлобиазы 19,2 ед/мл.

Пример 10. Осуществляют процесс 55 согласно примеру 1, но в качестве источника получения липидов используют влажную биомассу мицелиального гриба Trichoderma

v tridae В КПМ-13/10, В ыход лип идов 7,0%, целлобиазная активность 19,4 ед/мл.

Пример 11. Осуществляют процесс согласно примеру 1, используют биомассу продуцента пектиназы Aspergillus foctidus

М-45. Выход липидов 7,5%, целлобиаэная активность 19,6 ед/мл.

Пример 12. Согласно примеру 1, но обработку влажной биомассы проводят в течение 5 мин 0,2%-ной уксусной кислотой.

Выход лицидов 4,2%, активность целлобиазы 13.5 ед/мл.

Пример 13, Согласно примеру 1, но обработку влажной биомассы проводят в течение 80 мин 4%-ной уксусной кислотой при

50 С. Выход липидов 2,9%, активность целлобиазы 12,8 ед/мл.

Пример 14. Согласно примеру 10, но экстракцию липидов проводят этанолом, содержащим 6,5% тринатрийфосфата, в течение 130 мин. Выход липидов 3,5%, активность целлобиазы 12, 5 ед/мл.

Пример 15. Согласно примеру 10, но экстракцию водно-липидной эмульсии проводят гексаном в течение 3 мин и полученные липиды добавляют в количестве 1%.

Выход полученных липидов 4,8%, активность

14, 3 ед/мл;

Таким образом, предлагаемый способ позволяет экстрагировать липиды из влажной биомассы микромицетов, являющейся отходом целевых ферментных производств, Преимущества способа состоят в том, что для экстракции используются дешевые малотоксичные и неканцерогенные растворители и реактивы, сокращается время процесса получения липидов (с 7-8 до 5-6 ч).

Регенерация растворителей делает способ экологически более чистым и более экономичным. Полученные липиды отличаются по составу нейтральных липидов от продукта, полученного известным способом, а именно содержат больше триглицеридов, свободных жирных кислот, меньше стеринов и особенно их эфиров. Высокое содержание ненасыщенных триглицеридов позволяет испольэовать полученные липиды в качестве пеногасителей.

Основные отличия в составе жирных кислот липидов, полученных по предлагаемому и известному способам, состоят в следующем (табл. 3).

Липиды, полученные предлагаемым способом, содержат в 1,1 раза меньше ненасыщенных кислот, чем липиды, полученные по известному способу. Однако при экстракции по предлагаемому способу содержание линоленовой кислоты в липидах в

2,06 раза выше, чем в липидах, полученных по известному способу. Высокое содержание линоленовой кислоты обусловливает высокую ценность полученных липидов с

1693055

Таблица 1

Ва иант опыта

12,4+0,3

12.1 +0,3

Таблица 2 точки зрения получения" из них препарата витамина (незаменимых жирных кислот).

Применение липидов, полученных по предлагаемому способу, в качестве стимуляторов биосинтеза целлобиаэы при их до- 5 бавлении в питательные среды позволяют производить дополнительно минимально

20-30 т продукции.

Преимущество предлагаемого способа, состоит также в том, что липиды экстрагиру- 10 ют из влажной, а не предварительно высушенной биомассы (промышленный способ экстракции). Такое решение приводит к существенной экономии энергии, расходуемой в процессе сушки, кроме того, 15 позволяет избежать окисления липидов и сохранить их полезные свойства.

Ф омула изобретения

1. Способ выделения липидов из биомассы микромицетов — продуцентов экзо- 20 гидролаз, включающий экстракцию органическими растворителями. о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения процесса и улучшения свойств получаемого продукта, биомассу предва- 25 рительно обрабатывают 0,3-3 -ным рас-

Липиды, полученные экстракцией этанолом и гексаном(предлагаемый способ) Липиды, полученные по известному способу (контроль I) Опыт без добавления липидов (контроль II} твором уксусной кислоты при 10-45 С в течение 10-75 мин, экстракцию проводят дважды в течение 40-120 мин с использованием в качестве экстрагента этанола,.содержащего 0,1-5 тринатрийфосфата, экстракты обьединяют, концентрируют выпариванием, а остаток в виде водно-липидной эмульсии дважды экстрагируют в течение 5-45 мин гексаном или смесью гексан-вода, после расслоения смеси отбирают липидсодержащие фракции, объединяют их, сушат и концентрируют.

2. Способ по и. 1, отличающийся тем, что при экстракции водно-липидной эмульсии используют смесь гексан-вода при соотношении компонентов соответственно 3:1.

3. Способ по и. 1, о тл и ч а ю щи и с я тем, что экстракцию этанолом проводят при массовом соотношении биомасса:этанол

1:3.

4, Способ по и. 1 и 2, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что экстракцию водно-липидной эмульсии гексаном или смесью гексан-вода осуществляют при использовании их в трехкратном объеме по отношению к объему водно-липидной эмульсии. еллобиазная активность, е /мл

19,8 0,2

1б93055

Таблица 3

Составитель, О.Скородумова

Редактор О.Юрковецкая Техред М.Моргентал Корректор Т.Малец

Заказ 4051 Тираж Подписное

8НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35; Раушская наб., 4/5

Производственно-.издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101