Способ получения 9 @ -гидроксиандрост-4-ен-3,17-диона

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, и может быть использовано при производстве стероидных фармацевтических средств. Цель изобретения - ускорение способа. Для осуществления способа используют штамм Mycobacterlum fortultum ZIMET 10849. Ферментацию проводят в присутствии тонко диспергированного полимера полиамида б, полиамида 11 или циклогексанон-формальдегид-конденсационной смолы в концентрации 10 г/л среды. При этом как трансформируемый стерин, так и полимер могут быть введены в культуральную среду на разных этапах ферментации как вместе, так и порознь, а процесс трансформации проводят либо в питательной среде, либо в фосфатном буфере. Для получения целевого продукта используют как один из стеринов, так и их смесь. Во всех случаях получено повышение выхода целевого продукта по сравнению со способами трансформации в отсутствие полимера. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„5U„„1694644 А1 (51)5 С 12 Р 33/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ИИ8КйЯД

ОПИСАНИЕ ИЗаБРЕТЕНИЯ,",--" -;

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (89) DD 232167 (48)22.01.86 (21) 7773159/13 (22) 31.10.83 (46) 30,11.91. Бюл. М 44 (71) Народное предприятие "Йенафарм" (DD) (72) Клере Герхольд, Петер Атрат, Петер Хезель, Лутц Блей, Ютта Калейс, Хельмут Гро, Гейдрун Науманн и Биргитт Готтшальд (00) (53) 615.361 (088.8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЙ 9а -ГИДРОК-СИАНДРОСТ-4-Е Н-3,17-ДИОНА (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности. и может быть использовано при производстве стероидных фармацевтических средств. Цель изобретения — ускорение способа. Для осуществления способа используют штамм

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа микробиологического получения производных андростана из стеринов, которые являются важными промежуточными продуктами в частичном синтезе стероидных фармацевтических средств.

Известен (см.описание к патенту ДЕ-AS

2647895 или относящиеся к тому же предмету параллельное описание к патенту DD

127455) микробиологический способ получения 9-ОН-АД из стеролов, в котором используется, депонированный как под номером регистрации NRRLB-8119, так и под номером регистрации DSM 752 микроорганизм вида Mycobacterium fortuitum . Избирательное превращение стерола в

Mycobacterium fortultum ZiMET 10849, Ферментацию проводят в присутствии тонко диспергированного полимера полиамида 6, полиамида 11 или циклогексанон-формальдегид-конденсационной смолы в концентрации 10 г/л среды. При этом как трансформируемый стерин, так и полимер могут быть введены в культуральную среду на разных этапах ферментации как вместе, так и порознь, а процесс трансформации проводят либо в питательной среде, либо в фосфатном буфере. Для получения целевого продукта используют как один из стеринов, так и их смесь. 8о всех случаях получено повышение выхода целевого продукта по сравнению со способами трансформации в отсутствие полимера. 2 з.п. ф-лы, 1 табл. указанный целевой продукт происходит при этом в аэробных и стерильных условиях культивирования в водных питательных средах, содержащих источники углерода и азо- О та, а также минеральные соли, причем превращаемый стерол используется в кон- О центрации, например, 10 г/л. ф

8виду нерастворимости в воде и высо- Д кой гидрофобности стеролов (как сито-. арго-, кампо-, холе-, и стигмастерол) ати вещества обладают лишь незначительной биологической доступностью, что в соответствии со специфической трансформационной способностью используемого микроорганизма ведет к большой продолжительности культивирования — до 15 сут.

После представления технического реше1694644

20

30

55 ния согласно патентному описанию 0Е-AS

2647895 сделано немало попыток, чтобы при помощи направленных добавок в ферментационную среду повлиять на биодоступность стеролов и тем самым увеличить общую скорость превращения и выходы, устраняя хотя бы один из неблагоприятных аспектов указанного выше технического решения. В качестве таких добавок используют органические растворители, определенные неионогенные поверхностно-активные вещества, а также специальные компоненты питательных сред (см., например Klesllch К. Stегоid conversions.

B кн. А.Н Rose (Ed.) Microbial enzymes and

bloconversions. Economic Microbiology, 5 (1980), 370 — 467..Academic Press; London, New Jork, Toronto, Sydney, San Francisco).

Добавки органических растворителей даже в низких концентрациях оказались неприемлемыми из-за своего токсического действия.

Добавки неоиногенных поверхностноактивных веществ и/или продуктов, которые одновременно можно рассматривать как компоненты питательных сред, сильно затрудняет переработку ферментационных сред, в частности экстрагирование производных андростата, как целевых продуктов, если их прибавляют в высоких концентрациях, необходимых для полного превращения стерола.

Цель изобретения — ускорение способа.

Для осуществления способа используют штамм Mycobacterlum fortultum N 10, депонированный в Центральном институте микробиологии и экспериментальной терапии под номером ZIMET ¹ 10849, который характеризуется следующими признаками.

Микроорганизм M.fortuitum ZIMET

10849 относится к быстрорастущим микроорганизмам, а согласно RY ¹ 10M — к группе нефотохромогенных микобактерий.

На пластинках агара образует белые или кремового цвета колонии, пигмент не образует даже в условиях 14-дневного непрерывного искусственного освещения, Для штамма характерен полиморфизм. При выращивании на arape развиваются переходные формы: тонкие палочки, короткие палочки, коксовидные. Часто палочки имеют на одном конце набухшую конфигурацию.

В жидкой питательной среде в условиях перемешивания образует сферические относительно плотно упакованные клеточные агрегаты, Отдельно располагающиеся клетки в препаратах наблюдаются редко, Штамм трансформирует Р-ситостерин в 9 а-гидроксиандростендион.

Для физиологической характеристики штамма применяют показатель производительности ациламидного обмена.

Штамм имеет высокую ацетамидазную, уреазную и аспарагиназную активность. Пиразинамид и аллантоин расщепляют в незначительной степени.

Способ осуществляют следующим образом.

Штамм выращивают в пробирках на глицерин-агаровых косяках в течение 3 — 4 дней при 35 С, Питательная среда имеет следующий состав: 2% глицерина, 0 5 пентона, 0,3% мясного экстракта, рН 7,0. В

500-миллиметровые круглодонные колбы помещают питательную среду Н 10/1, содержащую 0,1% (МН4)НгР04. 0,1% (NH4)Hz

Р04, 0,2% КНгР04, 0,5 глицерина, 1% дрожжевого экстракта, 10 мл раствора микроэлементов(0,2 HzSO4,0,1% NaCI, 0,05%

FeS04 7НгО. 0.05% ZnS04 7Нг0, 0,5%

М9304 ЗНгО, 0,005% CuS04 5HzO, 10 мл 0,1

HzS04 На 1 л Дистиллированной ВОДЫ).

10 г полиамида 11 с размером частиц 5 — 300 мкм, 10 г соответствующего ситостерина, 1 л дистиллированной воды, рН среды

7,0, засевают культурой М fortuitum. Ферментацию ведут в течение 2 — 6 дней

В отношении введения полимера и стеринового субстрата способ осуществляется по нижеследующим вариантам

Полимер используют во время выращивания в присутствии трансформируемого субстракта, т.е. приготовленный субстрат из трансформируемого стерина или смеси стеринов прибавляют к ферментационной жидкости в начале выращивания в концентрациях от 1 до 50 г/л, предпочтительно 10 г/л. Культуральную жидкость ферментируют при рН 6 — 8 при температуре 26 — 35 С. предпочтительно 28 С.

По окончании ферментации целевой йродукт отделяют, выделяют органическим раст.ворителем.

Полимер используют во времени выращивания в отсутствие трансформируемого субстракта, т.е. приготовленный субстрат прибавляют к ферментационной жидкости после 1 — 36-часового(предпочтительно 24часового) культивирования с полимером, ферментацию проводят аналогично описанномуу выше.

Полимер используют во время выращивания культуры в отсутствие трансформируемого субстрата стерина, т.е. штамм выращивают в питательной среде в присутствии полимера в течение 12 — 36 ч, а затем

1694644 перед проведением трансформации биомассу и полимер отделяют от питательной среды осаждением. Стериновый субстрат перемешивают с полученным осадком и суспендируют в буферном растворе, процесс проводят так, кэк описано в первом варианте, В качестве тонко диспергированного твердого гидрофобного органического полимера используют циклогексанонформальдегид-конденсационную смолу, например а-2, полиамид 6, или полиамид 11, В качестве трансформируемого субстрата используют сито-, эрго-, компе-, холе- или стигмэстерин либо смесь из этих стеринов. Продолжительность ферментации предпочтительно 4 дня, для экстракции целевого продукта используют бутилацетат.

Трансформацию стеринэ (по третьему варианту) проводят предпочтительно в 0,010,1 М фосфатном,буфере.

Использованием полимерной добавки (независимо от стадии введения последней) достигается повышение выхода целевого и родукта (9-0 Н-АД).

В таблице приведены сравнительные данные по выходу 9 -гидроксиандрост-4-ен3,17-диона (9-0Н-АД).

Пример 1. Двадцать 500-миллилитровых плоскодонных колб с 50 мл питательной среды, содержащей, г: дрожжевой экстракт 10, глицерин 10, КНгР04 0,5:

К2 Н Р04 0,5; (NH ) H P 04 1,5; Mg S04 7 Н20 0,2;

Ее50г 7Н20 0,01; ZnS04 7Н О 0,02, полиамид 11 — 0,5, ситостерин 0,5, и 1000 мл дистиллированной воды (рН 7), засевают 5 мл

48-часовой культуры штамма М. fortuitum N

10. Дальнейшее культивирование осуществляют при 20 С на круговой качалке, после

48-часовой ферментации отделяют оттвердой фазы, экстрагируют бутилацетатом и выделяют 9-ОН-АД. Получают 5 г 9-0Н-АД, что в сравнении с прототипом соответствует увеличению выхода на 40 .

Пример 2. М. fortuitum N 10 культивируют в соответствии с примером 1, но в качестве полимера используют полимид 6.

Выход 9-ОН-АД составляет 4,0 r.

Пример 3, Осуществляют способ в соответствии с примером 1, но в качестве полимера используют циклогексанон-формэльдегид-конденсэционную смолу (а — 2).

Выход целевого продукта 4,5 г.

Пример 4. Способ осуществляют с примером 1, но используют смесь стеринов, состоящую из 55 Р -ситостерина, б кампестерина и 39 стигмастерина. Выход целевого продукта 5,3 г.

Пример 5. Способ осуществляют в соответствии с примером 1, но в питательную среду вносят 0,5 г полиамида 11 (зернистость(00 мкм) без добавления

5 трансформируемого субстрата. После культивирования смесь полимеров и культуры отделяют центрифугированием и прибавляют по 0,5 г смеси стеринов (пример 4), ферментируют в течение 48 ч и после этого выделяют целевой продукт. Выход 5,5 г.

Пример 6. В 20 плоскодонных колб емкостью 500 мл с 50 мл питательной среды добавляют по 0,5 r полиамида 11, засевают по 5 мл суспензии 48-часовой культуры М.

fortuitum N 10 и культивируют в течение 24 ч при 28О С на круговой качалке. Для трансформации стерина биомассу с полимером отделяют и по 2,5 г помещают в колбы емкостью 500 M/l, содержащие по 50 MR фосфаткого буфера по зеренсену, рН 8,0. В колбы вносят по 0,5 г смеси стеринов (пример 4) и помещают на круговую качалку. Через 96 ч инкубирования выделяют целевой продукт.

Выход 9-ОН-АД 4,0 г.

Пример 7. Трансформацию проводят в соответствии с примером б, но в качестве полимера используют циклогексанон-формальдегид-конденсационную смолу (a - 2).

Выход целевого продукта 3,3 г.

Пример 8. Способ осуществляют по примеру б, но используют полиамид б, Выход целевого продукта 2,7 г, Формула изобретения

1. Способ получения 9 а - гидроксиандрост-4-ен-3,17-диона путем трансформации субстрата в процессе ферментаций штаммэМусооаИегЪт fortuitum в аэробных условиях в жидкой питательной

40 среде, содержащей источники азота и углерода и минеральные соли, с последующим выделением и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, трансформацию субстрата осуществляют с помощью штамма Mycobakterium fartuitum Z1MET 10849, а ферментацию ведут в присутствии тонко диспергированного полимера полиамида 6, полиамида 11 или циклогексанон-формаль50 дегид-конденсационной смолы в концентрации 10 г/л среды.

2, Способ по п.1, отличающийся тем, что полимер вносят в питательную среду одновременно с субстратом.

3. Способ по и. 1, О т л и ч э ю щ и и с Я тем, что культуру подращивают в присутствии полимера, затем смесь полимера и биомассы отделяют от культуральной, среды, смешивают с субстратом и трансформацию ведут в фосфатном буфере., 1694644

Составитель Г.Смирнова

Техред M.Mîðãåíòàë Корректор, М.Кучерявая

Редактор M.Ïåòðîsà

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Заказ 4658 Тираж 350 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5